Purificação de bacteriófagos em escala-industrial — seção "Esclarecimento" e "Ultrafiltração"
Os bacteriófagos, também conhecidos como fagos, são vírus que infectam bactérias. Um fago não pode sobreviver sozinho; ele deve parasitar uma bactéria hospedeira para se reproduzir, causando a lise da bactéria. Devido às suas propriedades únicas, os fagos podem ser utilizados clinicamente para identificação e tipagem bacteriana, bem como para o tratamento de certas infecções bacterianas refratárias.
Este é um diagrama esquemático de uma estrutura de bacteriófago (fonte da imagem: internet).
Estima-se que as doenças das plantas causam mais de 30% das perdas globais de rendimento das culturas a cada ano. Entre vários patógenos, as doenças bacterianas são particularmente difíceis de controlar. Os métodos de controle tradicionais dependem principalmente de antibióticos e agentes à base de-cobre. No entanto, o uso excessivo de antibióticos levou a uma resistência antimicrobiana cada vez mais grave, enquanto o uso-de longo prazo de compostos de cobre resulta em acumulação ambiental, representando riscos à saúde de humanos e animais.
Como os bacteriófagos têm alta especificidade, eles podem matar seletivamente bactérias patogênicas sem prejudicar micróbios benéficos ou outras células hospedeiras. Portanto, os fagos podem servir como alternativas aos antibióticos e aos agentes-à base de cobre. Através da terapia fágica, os patógenos podem ser efetivamente eliminados, reduzindo o uso de antibióticos e compostos de cobre.
Com os contínuos avanços científicos e tecnológicos e pesquisas mais aprofundadas sobre bacteriófagos, as perspectivas de utilização de fagos para tratar superbactérias estão se tornando cada vez mais promissoras. No futuro, espera-se que a terapia fágica se torne uma das principais soluções para a resistência aos antibióticos. Através de investigação e exploração contínuas, a terapia fágica pode emergir como uma força importante no campo do tratamento antimicrobiano, fazendo maiores contribuições para a saúde humana.
No entanto, para administrar bacteriófagos ao corpo humano de forma segura e eficaz,-especialmente por meio de injeção intravenosa (IV),-ainda resta um grande desafio:como obter preparações de fagos ultra{0}}puros.
O lisado de fago é uma mistura complexa que, além dos fagos alvo, contém impurezas importantes, como: bactérias hospedeiras e seus fragmentos, DNA genômico e proteínas hospedeiras (impurezas relacionadas ao hospedeiro); endotoxinas, como lipopolissacarídeos (LPS) (impurezas relacionadas-ao processo); e impurezas-relacionadas ao produto, incluindo capsídeos vazios e caudas quebradas.
Portanto, o objetivo da purificação não é apenas atingir um título alto de fagos, mas também reduzir impurezas-particularmente endotoxinas, DNA hospedeiro e proteínas-a níveis extremamente baixos, conforme especificado pelos padrões da farmacopeia.
Um processo de purificação de fagos robusto e escalonável geralmente segue os princípios comuns do processamento downstream e pode ser dividido nas seguintes etapas lógicas:
Processo de purificação a jusante de bacteriófagos
Esclarecimento – Remoção de Impurezas Macroscópicas
Na fase inicial da purificação do bacteriófago, o objetivo principal da etapa de clarificação é remover eficientemente células bacterianas intactas e grandes detritos celulares do lisado bruto. O objetivo principal desta etapa é fornecer uma alimentação limpa para colunas de cromatografia downstream ou unidades de separação por membrana, minimizando a carga de partículas sólidas. Isto evita efetivamente o entupimento nas unidades de purificação subsequentes, garantindo uma operação estável e alta eficiência do processo durante todo o fluxo de trabalho de purificação.
Nos processos downstream tradicionais de bacteriófagos, a clarificação normalmente depende de centrifugação de baixa-velocidade combinada com filtração de profundidade de vários-estágios-geralmente passando sequencialmente por filtros de 0,8μm, 0,45μm e 0,22μm-para remover com eficiência detritos e impurezas da célula hospedeira. Embora madura e confiável, essa abordagem envolve diversas etapas, é demorada-e requer transferências repetidas de materiais, deixando espaço para otimização no rendimento e na eficiência geral.
Substituir a filtragem de profundidade de vários-estágios por umcápsula de microfiltraçãopode simplificar e intensificar significativamente o processo. Especificamente, depois de remover a maior parte dos detritos celulares por meio de centrifugação-de baixa velocidade, o lisado pode ser processado diretamente porfiltração de fluxo tangencial (TFF)utilizando cápsulas de microfiltração com tamanhos de poros definidos (0,45μm ou 0,22μm). Isto permite a remoção fina de impurezas particuladas e a permeação eficiente de fagos alvo em umpasso único, integrando efetivamente os três estágios de filtração tradicionais em um.
Esta inovação não apenas reduz significativamente o tempo de operação e o manuseio manual, mas também minimiza a perda de amostras e o risco de contaminação causado por múltiplas etapas de filtração, melhorando assim a recuperação geral de fagos. Enquanto isso, a operação de fluxo tangencial atenua a incrustação da membrana, melhora o rendimento e fortalece a robustez do processo.
Portanto, adotar umaestratégia de clarificação integrada que combina centrifugação-de baixa velocidade e cápsulas de microfiltraçãorepresenta uma abordagem eficaz para melhorar a eficiência e o custo{0}}da produção de bacteriófagos em grande-escala. As cápsulas de microfiltração da Guidling Technology normalmente podem reduzir a turbidez da alimentação para menos de20 NTU, atendendo plenamente aos requisitos das etapas subsequentes de ultrafiltração e cromatografia.
Captura e Concentração – Purificação Primária e Redução de Volume
Durante ocaptura e concentraçãoNa fase de purificação de bacteriófagos, o objetivo principal é recuperar eficientemente fagos de grandes volumes de lisado clarificado e, ao mesmo tempo, atingir a concentração do produto primário e a troca de tampão. Esta etapa depende principalmenteFiltragem de Fluxo Tangencial (TFF)tecnologia.
O princípio do TFF reside no uso de membranas de ultrafiltração com limites específicos de peso molecular-(normalmente 100 ou 300kDa). Pequenas impurezas moleculares, como componentes residuais do meio de cultura, metabólitos e pequenas proteínas, passam seletivamente através dos poros da membrana, enquanto os fagos são retidos no retentado devido aefeitos de exclusão de tamanho, possibilitando sua efetiva separação e enriquecimento.
Dentro de um sistema TFF,modo de ultrafiltraçãoé empregado para atingir a concentração de volume, enquanto muda paramodo de diafiltraçãopermite a troca de tampão, criando assim condições físico-químicas adequadas para etapas subsequentes, como o tratamento enzimático.
Esta tecnologia oferece as vantagens combinadas dealta eficiência de processamentoeexcelente escalabilidade, tornando-o ideal para produção em-grande escala. De acordo com a GuidlingTechnology, as cápsulas de ultrafiltração normalmente atingem umtaxa de recuperação de fagos de 90–95%, dependendo do material específico que está sendo processado.
Purificação Profunda – Remoção Direcionada de Impurezas Críticas
Na purificação de bacteriófagos,purificação profundaé a etapa chave que determina a qualidade do produto final. Seu objetivo principal é oremoção específica de impurezas críticas, como endotoxinas. TradicionalCentrifugação em gradiente de densidade CsCl-devido à sua toxicidade e falta de escalabilidade-foi eliminado dos processos industriais. As abordagens atuais concentram-se emtecnologias baseadas em cromatografia-, com integração inovadora depré-tratamento enzimático.
Uma estratégia avançada que combinacromatografia de troca aniônica (AEC)compré-tratamento com fosfatase alcalina (AP)foi desenvolvido. Tanto os fagos quanto os lipopolissacarídeos (LPS) carregam cargas negativas, levando à competição por locais de ligação em processos convencionais de AEC e causando co-eluição que reduz a eficiência da purificação. Ao introduzir o pré-tratamento AP antes do carregamento de AEC, a enzima remove especificamente grupos fosfato das regiões lipídicas A e polissacarídicas centrais das moléculas de LPS, reduzindo significativamente sua carga negativa líquida. Isto enfraquece efectivamente a sua afinidade pelo meio de permuta aniónica.
Dados experimentais mostram que tratar a amostra com20 U/mL APseguido de purificação usandoadsorvedores de membrana de ligante de amina quaternária (Q) ou colunas monolíticaspode alcançar até98,8% de remoção de endotoxinas, mantendo excelentes taxas de recuperação de fagos. Essa abordagem resolve com êxito o problema-de longa data da co{2}}adsorção de endotoxinas durante a purificação do fago
Polimento – Refinamento Final e Formulação
Na finalestágio de polimentoda purificação de bacteriófagos, o objetivo principal é alcançar pureza máxima e prontidão de formulação. Isso inclui a remoção de vestígios de impurezas residuais, a eliminação de aditivos introduzidos durante o processo (como a fosfatase alcalina) e a troca completa do produto em um sistema tampão-compatível com a formulação.
Isto normalmente é conseguido atravésdiafiltração secundária, um método comprovado e eficiente que permite a remoção profunda de pequenas-moléculas contaminantes e a troca completa de buffer.
Para aumentar ainda mais a pureza do produto,cromatografia de interação-de ligação de hidrogêniooucromatografia de modo-misto (MMC)pode ser introduzido como umetapa final de polimento. Estas técnicas utilizam mecanismos de separação multidimensionais para remover vestígios de componentes com propriedades físico-químicas semelhantes às do fago alvo. O resultado é um ingrediente farmacêutico ativo (API) bacteriófago altamente purificado que atende aos rigorosos padrões de qualidade exigidos paraformulações de grau-de injeção.
Ao selecionar uma combinação de módulos de membrana de microfiltração e ultrafiltração com uma área de membrana de 1 m², o volume máximo estimado de bacteriófago que pode ser processado atinge até 100 L. O fluxo do material de microfiltração é de aproximadamente 20–50 LMH, e o fluxo do material de ultrafiltração é de aproximadamente 15–30 LMH. Em comparação com os métodos de processamento tradicionais, esta abordagem pode atender com eficiência aos requisitos do processo tanto para clarificação quanto para ultrafiltração.
Referências:
Saavedra e outros,Purificação escalonável de preparações de bacteriófagos (2025)
Lapras e outros,Racionalização do processo de purificação de um insumo farmacêutico ativo fago (2024)