Análise completa do processo de fabricação de medicamentos MRNA: como a tecnologia TFF resolve os desafios de purificação
Nos últimos anos, a tecnologia de mRNA alcançou progressos revolucionários no campo biofarmacêutico, demonstrando um enorme potencial de aplicação, particularmente em vacinas e terapia genética. O desenvolvimento bem sucedido de vacinas de mRNA não só proporcionou novas soluções para a prevenção e controlo de doenças infecciosas, mas também impulsionou avanços na imunoterapia contra o cancro e na medicina personalizada. Como uma nova classe de produtos terapêuticos, a fabricação de mRNA em grande-escala é altamente desafiadora, envolvendo o controle da estabilidade do RNA, a remoção de enzimas residuais e subprodutos de reação-, a troca de buffers e a obtenção de altas-taxas de recuperação de pureza, todos os quais exigem tecnologias de fabricação com soluções-aprovadas pela regulamentação.
O processo de fabricação de vacinas ou terapêuticas de mRNA é dividido principalmente em três etapas: preparação da solução a granel de DNA plasmidial, preparação da solução a granel de mRNA e preparação do medicamento mRNA-LNP.
Fluxograma do processo de fabricação de medicamentos mRNA
A filtração de fluxo tangencial (TFF), como uma tecnologia de separação de membrana bem{0}}estabelecida, é amplamente aplicada na fabricação de mRNA devido à sua capacidade de peneiramento molecular de alta-eficiência, troca de buffer controlável e características de baixa tensão de cisalhamento. Com base no projeto do módulo de membrana, as configurações comuns de TFF incluem cassetes de-folhas planas e módulos de fibra-ocas. Além disso, a separação-de membrana orientada por pressão em TFF pode ser classificada em microfiltração (MF), ultrafiltração (UF), nanofiltração (NF) e osmose reversa (RO) de acordo com o tamanho dos poros da membrana, com seletividade progressivamente crescente.
O TFF desempenha um papel crítico em vários estágios da fabricação de medicamentos de mRNA, incluindo a preparação de massa de DNA plasmidial, produção em massa de mRNA e a formulação final de medicamentos de mRNA-LNP. Através da seleção apropriada do tipo de membrana, corte de peso molecular-(MWCO) e material de membrana, o TFF permite a remoção eficiente de subprodutos de reação e impurezas de baixo peso-molecular-, além de facilitar a troca e concentração de buffer antes e depois do encapsulamento de LNP. Isso aumenta significativamente a pureza, a estabilidade e a escalabilidade geral do processo do RNA.
Além disso, o desempenho da filtração de fluxo tangencial é influenciado por fatores de configuração do sistema, como tipo de bomba e projeto da tubulação, bem como parâmetros-chave do processo, incluindo pressão transmembrana (TMP), tensão de cisalhamento e fluxo de filtração. Esses fatores devem ser cuidadosamente selecionados e otimizados com base nas características do produto alvo, especialmente para produtos-sensíveis ao estresse, como mRNA-LNP, que são altamente suscetíveis a forças mecânicas externas durante o processamento.
Purificação de DNA plasmídico
A preparação da solução estoque de DNA plasmídico é fundamentalmente baseada no desenho da sequência do modelo de transcrição. Os métodos de preparação envolvem tipicamente a amplificação do DNA plasmídico, embora a amplificação por PCR também possa ser usada. Tomando a amplificação de DNA como exemplo,E. colié comumente usado para amplificação-baseada em fermentação. O processo de purificação a jusante inclui principalmente coleta de células, lise e clarificação, concentração e troca de tampão, filtração estéril, linearização e purificação cromatográfica. Em ambientes industriais, a centrifugação de fluxo contínuo é frequentemente usada para coleta de células, mas gera forças de cisalhamento relativamente altas. Os sistemas de fibra oca, com seus canais abertos e baixo cisalhamento, são mais adequados para manusear amostras com alto teor de sólidos, alta viscosidade ou sensibilidade ao cisalhamento, como DNA plasmidial. Após a coleta, as células são submetidas a homogeneização de alta-pressão, ultrassonicação ou lise alcalina, seguida de clarificação preliminar por meio de filtração profunda.
Para facilitar a cromatografia subsequente, a filtração de fluxo tangencial (TFF) usando cassetes de membrana ou colunas de fibra oca com cortes de peso molecular-de 30 kDa, 100 kDa ou 300 kDa é frequentemente empregada primeiro para concentração e troca de buffer. Isto reduz o volume da amostra e remove simultaneamente algumas impurezas, como RNA, proteínas da célula hospedeira (HCP) e fragmentos de DNA da célula hospedeira (HCD). A cromatografia serve como etapa de purificação do núcleo. Normalmente, a cromatografia de troca aniônica (AEX) é combinada com a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para remover eficientemente as impurezas e enriquecer o DNA plasmídico superenrolado altamente bioativo, melhorando significativamente a pureza do plasmídeo.
Após a purificação, o plasmídeo é submetido a TFF novamente para concentrar a solução na concentração alvo (geralmente 0,5–2 mg/mL) e para realizar diálise com o tampão de armazenamento final. Esta etapa remove sais residuais e solventes orgânicos do processo, garantindo que o sistema tampão atenda aos requisitos para reações de transcrição in vitro (IVT) a jusante.
Purificação de mRNA transcrito in vitro (IVT)
A transcrição e modificação in vitro (IVT) são os processos chave para a preparação de soluções estoque de mRNA. Durante a produção de mRNA IVT, é empregada uma combinação de filtração de fluxo tangencial (TFF1) – cromatografia – filtração de fluxo tangencial (TFF2). Essa estratégia garante uma purificação eficiente e de{4}}alta qualidade do mRNA, fornecendo suporte essencial para a fabricação de vacinas.
Após a conclusão das reações de transcrição e modificação, a ultrafiltração/diafiltração usando cassetes de membrana ou colunas de fibra oca com cortes de peso molecular-de 30 kDa, 100 kDa ou 300 kDa normalmente é realizada primeiro. Esta etapa remove efetivamente várias impurezas relacionadas-ao processo do sistema de reação, como RNA polimerase, fragmentos de DNA residuais, NTPs que não reagiram, enzimas de proteção, RNA de-fita dupla (dsRNA) e inibidores de moléculas-pequenas, ao mesmo tempo em que consegue a troca de buffer. Após uma única etapa de filtração de fluxo tangencial, a maioria das impurezas é efetivamente removida e a única impureza proteica residual detectável é a RNA polimerase.
Posteriormente, múltiplas técnicas de cromatografia são aplicadas para purificação adicional. Os métodos comumente usados incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de{1}exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa-de pares iônicos-e cromatografia de troca-iônica. Através desta combinação de ultrafiltração e cromatografia sequencial, o mRNA atinge um alto nível de pureza.
Para atender aos requisitos de formulação ou armazenamento, a solução estoque de mRNA é novamente concentrada ou diluída usando cassetes de membrana de 30 kDa, 100 kDa ou 300 kDa ou colunas de fibra oca para ajustar com precisão a concentração alvo e trocar no tampão de formulação final. Por fim, é aplicada uma filtração de grau-estéril para controlar a carga microbiana, completando o armazenamento temporário e o enchimento do material.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Purificação de formulações de mRNA-LNP
As nanopartículas lipídicas (LNPs) são atualmente o sistema de entrega mais extensivamente estudado para a terapêutica de mRNA. Atualmente, várias formulações de mRNA{1}}LNP estão em diferentes estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico. Os LNPs são altamente sensíveis aos processos de fabricação. Entre as operações unitárias necessárias para a produção de mRNA{4}}LNP, concentração e troca de buffer por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF), bem como filtração estéril, apresentam desafios significativos. Essas etapas devem ser cuidadosamente otimizadas para garantir a escalabilidade do processo e a qualidade do produto, evitando problemas como incrustações na membrana e carregamento incorreto do filtro.
Após o encapsulamento do mRNA, a filtração de fluxo tangencial (TFF) é usada para purificação. O objetivo desta etapa é remover mRNA não encapsulado, polímeros livres ou materiais lipídicos, bem como solventes residuais de mRNA e lipídios. Como os LNPs-de mRNA apresentam estabilidade limitada à temperatura ambiente, a otimização dos processos downstream, incluindo o TFF, é fundamental para manter a qualidade do produto.
As principais orientações de otimização incluem: definir adequadamente a pressão transmembrana (TMP) e a taxa de fluxo tangencial com base no tamanho das partículas e na estabilidade dos LNPs-de mRNA para equilibrar a eficiência da filtração e o estresse das partículas; selecionar membranas ou colunas de fibra oca com cortes de peso molecular-adequados (MWCO, por exemplo, 100 kDa ou 300 kDa) para remover com eficiência mRNA livre, impurezas e tampão de troca, minimizando a adsorção ou danos de partículas; e otimizar os volumes de concentração e diafiltração para garantir a troca eficaz de tampão na formulação alvo e controlar a concentração e dispersão final das partículas.
Além disso, atributos críticos de qualidade (como tamanho de partícula, índice de polidispersidade [PDI] e eficiência de encapsulamento de mRNA) devem ser monitorados de perto durante o processo, e os parâmetros ajustados dinamicamente com base em-dados em tempo real para obter purificação e formulação estáveis, escalonáveis e eficientes de LNPs-de mRNA.
Além disso, devido à instabilidade dos LNPs-de mRNA e seus componentes sob métodos de esterilização terminal, um filtro de grau-estéril de 0,2 µm é normalmente usado para remover bactérias e outros contaminantes microbianos.