Processo de purificação downstream em escala-industrial para vacina contra rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) — Seção "Ultrafiltração"

A rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) é causada pela infecção pelo vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBRV), também conhecido como herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1). A doença é caracterizada principalmente por sintomas respiratórios e aborto. Além destas manifestações clínicas, a IBR pode levar à redução da produção de leite no gado leiteiro e à diminuição do ganho de peso no gado de corte, resultando em perdas económicas significativas para as explorações pecuárias.

A doença é de natureza imunossupressora. Quando ocorre como infecção única, sua patogenicidade é relativamente baixa; contudo, quando ocorrem infecções mistas com outras doenças virais ou bacterianas, a gravidade e os danos aumentam significativamente. A vacinação é o método mais eficaz de prevenção e controlo, estando disponíveis dois tipos principais de vacinas: vacinas vivas atenuadas e vacinas inactivadas. Atualmente, as vacinas contra rinotraqueíte infecciosa bovina utilizadas nas fazendas são predominantemente vacinas inativadas.

As vacinas vivas atenuadas são caracterizadas por forte imunogenicidade, rápido início de imunidade e longa duração de proteção (geralmente mais de seis meses). Eles são comumente usados ​​para imunização de emergência durante surtos de doenças. No entanto, eles apresentam riscos potenciais de disseminação do vírus, representam riscos para vacas prenhes e não podem ser usados ​​em bovinos com infecção latente, mas assintomáticos.

As vacinas inativadas caracterizam-se pela alta segurança, sem risco de disseminação do vírus ou reversão à virulência, e são consideradas absolutamente seguras. Eles podem ser usados ​​em bovinos em todos os estágios, incluindo vacas prenhes, bezerros e touros reprodutores. No entanto, o início da imunidade é relativamente lento e a duração da protecção é mais curta, pelo que são geralmente necessárias imunizações de reforço. Em alguns casos, a eficácia protetora pode ser mais fraca do que a das vacinas vivas atenuadas.

Independentemente de ser utilizada uma vacina viva atenuada ou uma vacina inativada, o processo de purificação a jusante pode ser dividido em quatro etapas principais: colheita e clarificação → concentração e purificação primária → purificação de polimento → inativação/filtração estéril e formulação.

A concentração é uma etapa central no processo de purificação posterior das vacinas, imediatamente após o esclarecimento. Seu objetivo principal é reduzir rapidamente a solução clarificada de vírus de grande-volume e baixa{2}}concentração colhida para uma forma de pequeno-volume e alta{4}}concentração, mantendo a bioatividade viral. Isso cria as condições necessárias para etapas subsequentes de purificação fina de alta-resolução, mas de baixa{7}}capacidade, como a cromatografia.

Esta etapa é normalmente realizada usando ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF). O princípio é o seguinte: a solução de alimentação viral flui paralelamente à superfície de uma membrana de ultrafiltração com um tamanho de poro específico. Sob pressão, pequenas moléculas como água, sais e certas impurezas passam perpendicularmente através da membrana e são removidas, enquanto partículas virais intactas, que são muito maiores que os poros da membrana, são retidas, recirculadas continuamente e concentradas. Em comparação com a centrifugação tradicional-de alta velocidade, esse método é mais suave para vírus frágeis como o IBRV, que possuem um envelope lipídico. Ele reduz efetivamente os danos estruturais do vírus e a perda de atividade causada por altas forças de cisalhamento e é mais adequado ao aumento linear-da produção industrial.

Uma operação de concentração bem sucedida é muito mais do que simplesmente reduzir o volume. Os pontos-chave para a otimização do processo incluem: controlar com precisão a pressão transmembrana e a vazão de alimentação para equilibrar a eficiência da filtração e, ao mesmo tempo, minimizar a polarização da concentração e a incrustação da membrana; seleção de material de membrana e tamanho de poro apropriados para garantir alta retenção de vírus e fluxo de permeado; e encontrar o equilíbrio ideal entre recuperação de vírus, fator de concentração e tempo de processamento. A suspensão viral concentrada não apenas atinge um título significativamente mais alto, mas também atinge a purificação preliminar removendo uma grande porção de impurezas solúveis em água-. Isso fornece a base necessária de volume e concentração para etapas críticas subsequentes de refinamento, como cromatografia e tratamento com nuclease, tornando a concentração um centro de eficiência central em todo o processo downstream.

A diafiltração secundária é uma etapa crítica na purificação a jusante da vacina, posicionada após a purificação fina e antes da formulação. É normalmente realizado após cromatografia e tratamento com nuclease. Seu objetivo principal não é a concentração inicial, mas a troca de sistemas e o ajuste preciso das condições finais da formulação. O processo é realizado em um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF), onde o tampão de formulação fresco e limpo é continuamente adicionado à solução viral concentrada circulante, enquanto o solvente original e pequenas impurezas de -moléculas são removidos. Esta operação elimina de forma eficaz e suave sais residuais, solventes orgânicos, produtos de degradação de nuclease e vestígios de impurezas solúveis remanescentes do processo de purificação.

A chave é manter o volume constante ou aplicar pequenos ajustes de concentração para garantir que a concentração do vírus atenda às especificações da formulação. Para vírus frágeis e envelopados, como o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBRV), o ambiente hidrodinâmico suave da diafiltração secundária é crucial para preservar a integridade e a imunogenicidade das partículas. Em última análise, esta etapa fornece uma base sólida para subsequente inativação (se necessário), adição de adjuvante ou estabilizador e enchimento final, garantindo que o produto final entre na formulação com componentes definidos, condições uniformes e boa compatibilidade. É, portanto, uma das etapas principais para garantir a segurança, a estabilidade e a consistência de lote-a{4}}da vacina.

O IBRV é um vírus de DNA linear de fita dupla-envelopado com um envelope aproximadamente esférico. Partículas maduras de IBRV têm um diâmetro de cerca de 160–230 nm. Consequentemente, o uso de membranas de ultrafiltração de 100, 300 ou 500 kDa pode reter o IBRV enquanto remove algumas proteínas contaminantes. A taxa de recuperação de ultrafiltração dos cassetes de membrana da Jiuling Technology varia com o tipo de material de alimentação, mas geralmente atinge 90–95%.