Tecnologia de inativação e remoção de vírus de hemoderivados
Os produtos sanguíneos são "componentes de proteínas plasmáticas ou componentes de células sanguíneas, tais como albumina sanguínea humana, imunoglobulina humana, fator de coagulação humana (natural ou recombinante), concentrado de glóbulos vermelhos, etc., separados de plasma humano saudável ou plasma humano especificamente imune, purificado ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante, para diagnóstico, terapia ou imunoprofilaxia passiva". Os produtos sanguíneos desempenham um papel importante nas emergências médicas, no resgate de feridos de guerra e na prevenção e tratamento de algumas doenças específicas.
Contexto regulatório
As práticas de garantia de segurança precisam garantir que o medicamento final seja seguro para os reguladores e, em última análise, para os pacientes e o público. Na década de 1990, a Conferência de Coordenação Internacional (ICH 1998) emitiu "Q5A: Avaliação de Segurança Viral de Produtos Biotecnológicos de Linhas Celulares de Origem Humana ou Animal" (Q5A: Avaliação de Segurança Viral), estabelecendo um padrão mundial para segurança viral.
O ICH Q5A descreve um esquema de vários níveis para testar e liberar a validação para atingir esse objetivo. O programa de testes concentra-se na colheita de bancos de células, matérias-primas e biorreatores, complementados pela análise de risco do produto. Além dos testes, o ICH Q5A exige que a descontaminação a jusante seja avaliada como uma medida à prova de falhas quando nenhum contaminante for detectado a montante. A verificação da autorização garante que, se algum vírus escapar do regime de testes, ele poderá ser removido e/ou inativado antes de chegar ao medicamento final.
Antecedentes do programa geral de segurança contra vírus
Na moderna fabricação de biotecnologia (ou bioprocessamento), geralmente existem três ou quatro operações unitárias em toda a sequência purificada, capazes de remover ou inativar o vírus. Isto inclui certas etapas cromatográficas (como proteína A ou troca aniônica), cultura de pH baixo ou detergentes e filtros de retenção de vírus. Nem todas essas etapas removerão ou inativarão efetivamente todos os vírus.
Por exemplo, a cultura de pH baixo é geralmente ineficaz para a inativação de vírus sem envelope, mas funciona bem para a inativação de vírus com envelope. Sob certas condições operacionais, a coluna de troca aniônica pode não ser capaz de se ligar e remover vírus isoelétricos neutros da corrente de produto, mas é eficaz contra vírus ácidos.
É uma combinação de três a quatro operações unitárias independentes e ortogonais que juntas garantem a segurança viral dos produtos biotecnológicos.
Geralmente, presume-se que uma etapa de processamento robusta, eficiente e confiável será capaz de remover ou inativar um grande número de vírus (normalmente definido como 4 log10 ou superior, onde o valor de redução de log ou LRV é calculado como o log10 do total número de vírus na entrada dividido pelo número total de vírus na saída). Contudo, o LRV não pode ser utilizado como uma medida única e absoluta da eficácia de uma medida. Os dados podem ser preliminares. É fácil de modelar, relativamente insensível a mudanças nas condições do processo e eficaz contra uma série de vírus (OMS 2004).
A filtração viral é amplamente reconhecida como uma etapa do processo poderosa e eficaz e é um componente-chave da estratégia geral para minimizar o risco de partículas virais exógenas e endógenas durante a fabricação de produtos biotecnológicos.
Os filtros virais geralmente funcionam por meio de mecanismos de retenção fortes e baseados no tamanho. Com base neste poderoso mecanismo de ação, os filtros virais têm maior probabilidade do que as etapas cromatográficas de fornecer retenção viral previsível para uma variedade de vírus. Isso ocorre porque é menos provável que o filtro seja afetado por diferenças nas propriedades físico-químicas de diferentes vírus e interações vírus-resina reguladas pelas condições operacionais. Portanto, a etapa de filtração viral é comumente usada em processos de purificação de proteínas terapêuticas recombinantes bem projetados (EMEA 1996), que também demonstraram ter desempenho robusto na indústria de processamento de plasma.
No entanto, os produtos sanguíneos são como uma faca de dois gumes, que não só salva milhares de vidas, mas também tem a possibilidade de espalhar doenças e constituir uma ameaça para a saúde humana. Segundo as estatísticas, de 1977 a 1984, pelo menos 30,{4}} receptores de sangue nos Estados Unidos receberam sangue infectado com o vírus da AIDS. Em 1985, 1.200 em cada 3{9}} hemofílicos na França foram infectados com AIDS através de transfusões de sangue ou produtos sanguíneos.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 5% a 10% das infecções por SIDA em todo o mundo são causadas por transfusões de sangue ou produtos sanguíneos infectados pela SIDA. O primeiro caso de SIDA na China foi infectado através da utilização de produtos sanguíneos importados infectados com o vírus da SIDA. Além disso, também foi relatada a transmissão de doenças da hepatite B e C devido à transfusão de sangue e hemoderivados.
1. Principais vírus transmitidos por hemoderivados e suas características
Existem muitos tipos de vírus que são transmitidos através de sangue e hemoderivados, conforme mostrado na Tabela 1. Entre eles, o HIV, o HBV e o HCV têm sido preocupados pelos círculos médicos nacionais e estrangeiros devido à sua alta taxa de infecção e aos graves danos.
Dado que o sangue e os produtos sanguíneos têm a possibilidade de espalhar vírus, isso afectou seriamente a sua aplicação na prevenção e tratamento de doenças. Portanto, na produção de hemoderivados, processos de inativação e remoção de vírus devem ser adicionados para garantir a segurança dos hemoderivados.
2. Principais métodos de inativação e remoção de vírus
A fim de garantir a segurança dos produtos sanguíneos, para além da selecção dos dadores de sangue, da imunização sempre que possível, dos testes rigorosos do sangue recolhido e de outras medidas, a inactivação e remoção do vírus, o tratamento dos produtos sanguíneos é um elo importante para garantir a segurança da transfusão de sangue. Vários métodos comumente usados e eficazes para inativar e remover vírus são descritos em detalhes abaixo.
I. Métodos de inativação de vírus
1. Método Pasteur
A base teórica deste método é que a taxa de destruição da estrutura do vírus é muito maior do que a da estrutura da proteína através da seleção da temperatura e do tempo de ação. Quase 50 anos de resultados de uso clínico e experimentos recentes em animais confirmaram que a albumina em solução após tratamento térmico de 60 graus e 10 horas, ou seja, desinfecção Pasteur, pode não apenas inativar o HBV, mas também inativar o HCV e o HIV, tornando a albumina a mais confiável hemoderivados na segurança viral.
Recentemente, o processo Pasteur foi estendido à produção de IVIG, FVI, FIX, fibrinogênio e outros produtos. Bridonnccu et al. adicionou esse processo de inativação do vírus ao processo IVIG de produção de etanol em baixa temperatura, ou seja, o método Pasteur foi implementado nas condições de ausência de estabilizante, baixo teor de sal e acidez, e o título do vírus diminuiu em 5 Log. Simmonds et al. testaram o vírus transmitido por transfusão (TTV) de preparações concentradas de FVⅢ e FIX clinicamente usadas no Reino Unido e descobriram que a taxa de detecção de TTV de produtos sem inativação do vírus Pasteur foi de 50% a 75%, e a taxa de detecção positiva de produtos após a inativação de Pasteur foi 0.
A taxa positiva de TTV foi de 27% em 84 pacientes com hemofilia no Reino Unido que usaram produtos com fator de coagulação não inativado, enquanto apenas 1 em cada 19 pacientes que usaram produtos com fator de coagulação inativado por vírus foi positivo, com uma taxa de detecção positiva de 5%. Portanto, o processo de inativação do vírus é muito eficaz para melhorar a segurança dos hemoderivados.
2. Solvente orgânico combinado com surfactante (método S/D)
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Um grande número de produtos sanguíneos inativados pelo método S/D provou ser seguro e confiável através de aplicação clínica de longo prazo, por isso são amplamente utilizados. No entanto, este método não tem capacidade de inativação contra parvovírus B19, HEV e outros vírus não revestidos com lipo.
3. Método de inativação por calor seco
A inativação por calor seco significa que a preparação liofilizada é tratada por aquecimento e o vírus é morto por calor seco. Os métodos de calor seco comumente usados são método de aquecimento de 60 graus ~ 80 graus, 10 ~ 72 horas e método de tratamento de 80 graus, 72 horas. Já no início da década de 1980, era útil aquecer a preparação concentrada liofilizada de FVIII e o complexo de protrombina a 60 a 80 graus por 10 a 72 horas. No entanto, foi provado que este método não pode inactivar completamente o HBV, HCV, HIV. O tratamento térmico seco a 80 graus e 72 horas provou ser eficaz na inativação do HBV, HCV e HIV. Houve também relatos recentes de preparações liofilizadas de fatores de coagulação tratadas a 100 graus. Xu Jinbo et al trataram IgG a 100 graus por 30 min e vírus da estomatite vesicular inativado 8.2 Log. Algumas pessoas liofilizam o FVIII a 68 graus por 72 horas, no estado seco e depois aquecidos a 100 graus por 0,5 ~ 1 h. Este método é relativamente econômico.
4. Método fotoquímico
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Log de células ligadas ao HIV e as plaquetas permaneceram boas após 7 dias de preservação funcional in vitro, que foi aprovada pela FDA para ensaios clínicos.
Entre esses métodos, o método de desinfecção Pasteur e o método S/D são aprovados pelo FDA dos Estados Unidos e são amplamente utilizados no mundo. O método de inativação por calor seco é principalmente adequado para inativação de vírus em preparações liofilizadas. O método fotoquímico tem um forte efeito de inativação em vírus revestidos de lipídios e tem sido usado na inativação de vírus plasmáticos completos na Europa e tem amplas perspectivas de inativação de vírus em componentes de células sanguíneas. No entanto, todos estes métodos têm as suas próprias deficiências, tais como a esterilização Pasteur não é ideal para a inactivação de alguns vírus resistentes ao calor; O método S/D não conseguiu inactivar eficazmente o vírus não revestido com lipo. O método fotoquímico danificou significativamente a atividade de algumas proteínas plasmáticas. O uso clínico atual de investigações de acompanhamento mostra que nenhum método de inativação de vírus pode garantir que os produtos sanguíneos estejam absolutamente livres do risco de transmissão de vírus.
I. Processo de remoção de vírus
Na produção de hemoderivados, um processo de inativação não pode inativar todos os vírus; Além disso, o próprio vírus é uma proteína heteróloga, tal como a entrada com o produto produzirá reações adversas; Ao mesmo tempo, devido à limitação do nível técnico, ainda existem vírus cujas características não são encontradas ou compreendidas, pelo que os métodos de inactivação de vírus existentes não podem garantir o efeito de inactivação destes vírus. Portanto, a inativação por si só não pode garantir a segurança do produto e deve ser removida do produto. Portanto, a tecnologia de remoção de vírus está recebendo cada vez mais atenção. Dois processos de remoção de vírus comumente usados e eficazes são brevemente descritos abaixo.
1. Tecnologia cromatográfica
A tecnologia cromatográfica refere-se ao uso de vários componentes e diferenças de afinidade ou interação de fase estacionária, para conseguir a separação de vários componentes. Por ser uma tecnologia avançada para a produção de hemoderivados, a própria cromatografia tem o efeito de remover vírus, especialmente cromatografia de afinidade e cromatografia de troca iônica. Para cromatografia de troca iônica, a eluição tem vantagens sobre a penetração na remoção de vírus. A Tabela 2 mostra as estatísticas dos dados da taxa de remoção do HAV por tecnologia cromatográfica no processo de produção de albumina pela CSL Company na Austrália. Como pode ser visto na Tabela 2, a cromatografia de troca iônica e a filtração em gel são mais eficazes na remoção do HAV, com uma taxa de remoção total de 10,9 Log.
Na produção de FVIII, a Baxter Healtheare realiza cromatografia de imunoafinidade usando géis tratados com anticorpos anti-FVIII, que podem remover (4,2±0,1)Log e (5,3±0,9)Log de não -vírus revestidos de lipídios, como PPV e HAV, respectivamente.
2. Filtragem de nanofilmes
Para alguns vírus com diâmetro superficial pequeno, como HAV e parvovírus B19, a filtração por nanomembranas é o método de remoção mais eficaz. Aproveita a diferença de tamanho entre proteínas e vírus e a adsorção de vírus pela membrana do filtro para isolar vírus. Um estudo de laboratório foi conduzido no Sanquin Blood Supply Site, na Holanda, sobre a remoção de vírus adicionando uma filtração de nanomembrana Planova 15N de uma etapa e dois estágios ao processo de produção do complexo de protrombina. Verificou-se que as taxas de remoção de HIV, HAV e outros vírus aumentaram em graus variados após a filtração por nanomembrana (ver Tabela 3).
No entanto, os seguintes problemas podem ocorrer quando este método é aplicado à produção industrial: Primeiro, devido à alta viscosidade do produto e à presença de proteínas de grande diâmetro, o tamanho dos poros da membrana selecionada pelo filtro não deve ser muito pequeno, limitando assim a remoção de vírus de pequeno diâmetro, como o HCV; Em segundo lugar, a estabilidade do controle do tamanho dos poros da membrana no processo de produção do filtro afetará a remoção do vírus. Terceiro, quando a abertura da membrana menor que o diâmetro da partícula do vírus é bloqueada, a taxa de fluxo do produto será reduzida, afetando o rendimento. Portanto, a seleção de membranas cujas propriedades e tamanho de poro sejam adequados às necessidades dos produtos processados é um fator importante para saber se a filtração por nanomembrana pode remover vírus.
3. Discussão
Sob a premissa de garantir a qualidade da fonte de sangue, o processo de inativação e remoção do vírus é um meio importante e necessário para garantir a segurança dos hemoderivados. A utilização de apenas um processo de vírus inactivado não pode garantir absolutamente a segurança dos produtos sanguíneos. Com base na tecnologia de inativação de vírus, a tecnologia de remoção de vírus, como cromatografia e filtração de nanofilme, foi adicionada, a taxa de remoção de vírus aumentou bastante e o efeito de inativação e remoção de vírus foi significativamente melhorado. Actualmente, a Europa propôs claramente que no processo de produção de produtos sanguíneos, pelo menos uma inactivação e remoção de vírus deve ser utilizada para garantir a segurança dos produtos sanguíneos.
Na China, a maioria dos fabricantes de hemoderivados usa apenas um processo de vírus inativado no processo de produção, como método de desinfecção Pasteur, método S/D, etc., mas não usa o processo de remoção de vírus, o que afeta seriamente a qualidade dos hemoderivados. Com a adesão da China à OMC, o processo de produção e os padrões de qualidade dos produtos sanguíneos nacionais estarão alinhados com o mundo, caso contrário, não poderá garantir a quota de mercado interno existente, mas também não poderá competir com produtos similares em outros países do mercado internacional.
Portanto, os fabricantes de hemoderivados da China devem melhorar o processo de produção, fortalecer a inativação e remoção do vírus, de modo a garantir plenamente a qualidade e segurança do produto. Portanto, será tendência para os fabricantes chineses de hemoderivados usarem cromatografia para purificar hemoderivados e remover vírus para garantir a segurança dos hemoderivados.
Sobre Guidling
A Guidling Technology é uma empresa nacional de alta tecnologia com foco em produtos biofarmacêuticos, cultura celular, purificação e concentração de biomedicina, diagnóstico e fluidos industriais. Desenvolvemos com sucesso dispositivos de filtro centrífugo, cassetes de ultrafiltração e microfiltração, filtro de vírus, sistema TFF, filtro de profundidade, fibra oca, etc. Nossas membranas e filtros de membrana são amplamente utilizados em concentração, extração e separação de pré-filtração, microfiltração, ultrafiltração e nanofiltração. Nossas diversas linhas de produtos, desde filtração laboratorial pequena e descartável até sistemas de filtração de produção, testes de esterilidade, fermentação, cultura celular e muito mais, atendem às necessidades de testes e produção. A Guidling Technology está ansiosa para cooperar com você!
