Processo de concentração de ultrafiltração/diafiltração a jusante: como prevenir eficazmente a permeação e perda de proteínas alvo
Processo de concentração de ultrafiltração/diafiltração a jusante: como prevenir eficazmente a permeação e perda de proteínas alvo
Em processos de purificação downstream para proteínas recombinantes, hemoderivados e outros produtos biológicos, a ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) é usada para concentração de matéria-prima, troca de buffer e remoção de sais e pequenas impurezas de-moléculas. A separação é obtida com base na peneiração da membrana: moléculas grandes, como anticorpos monoclonais (mAbs), são retidas pela membrana, enquanto sais, endotoxinas, proteínas livres da célula hospedeira (HCPs) e outras pequenas-impurezas de moléculas passam através da membrana e são removidos no permeado. Durante o escalonamento-do processo, a perda de proteína alvo através da membrana pode ocorrer prontamente, reduzindo diretamente o rendimento e aumentando os custos do lote. Em algumas condições operacionais, a proteína pode ser detectada no permeado, exigindo uma determinação rápida se os componentes vazados são mAb alvo intactos, agregados degradados/fragmentados ou proteínas da célula hospedeira. Este artigo está dividido em duas partes principais: revisa abordagens tradicionais-de controle de processos e, em combinação com o Design of Experiments (DOE), estabelece uma janela de processo robusta, apoiada por vários métodos analíticos para determinar a identidade das proteínas detectadas no permeado.
I. Principais causas da permeação da proteína alvo através da membrana durante UF/DF
1. Pressão transmembrana excessiva (TMP)
Quando a diferença de pressão através da membrana é muito alta, o arrasto do solvente é aumentado, forçando alguma proteína monomérica a entrar no permeado. Durante o aumento de escala-, o tanque de alimentação contém um volume maior de material e as flutuações de pressão na tubulação são mais pronunciadas, tornando a sobrepressão transitória mais provável do que em escala de laboratório.
2. Taxa de fluxo tangencial inadequada
Se a taxa de fluxo for muito baixa, uma densa camada de concentração-de polarização se formará na superfície da membrana, e a concentração local de proteína poderá exceder o limite de tolerância da membrana. Se a taxa de fluxo for muito alta, a tensão de cisalhamento pode causar clivagem estrutural do mAb, gerando fragmentos proteicos menores que podem passar livremente através dos poros da membrana.
3. Concentração excessivamente alta de proteína na matéria-prima
Quando a concentração de proteína na ração é muito alta, a proteína se acumula na superfície da membrana e alguma proteína monomérica pode ser transportada para o permeado. Esse é um problema comum na produção-em larga escala.
4. pH ou condutividade fora da faixa do processo
Mudanças nas características de carga da proteína podem reduzir seu raio de hidratação e tamanho aparente de partícula, resultando em permeação anormal da membrana.
5. Envelhecimento do cassete de membrana, alto fluxo difusivo ou pré-condicionamento insuficiente
Defeitos físicos no cassete de membrana podem causar vazamento direto de proteínas e representar um risco-relacionado ao equipamento. CIP repetido com soluções fortemente alcalinas pode danificar gradualmente o material da membrana de polietersulfona (PES).
6. Volume de diafiltração excessivo
Durante a diafiltração prolongada, a lavagem contínua com solvente pode gradualmente eliminar pequenas quantidades de proteína monomérica.
II. Medidas práticas tradicionais para prevenir a permeação e perda de proteínas alvo
(A) Controle de Parâmetros de Processo
1. Controle a pressão transmembrana (TMP)
Defina um limite de aviso de pressão superior e estabeleça alarmes de intertravamento para evitar impactos transitórios de alta-pressão na camada da membrana. Depois de determinar os parâmetros de linha de base em pequena escala, reduza a pressão operacional segura durante o{2}}aumento da produção e reserve um intervalo de tolerância de processo apropriado.
2. Otimize a taxa de fluxo cruzado
Estabeleça uma camada limite estável e reduza a polarização da concentração na superfície da membrana através do fluxo cruzado, minimizando assim o acúmulo de proteínas na superfície da membrana na fonte.
3. Limite a concentração final após concentração
Defina um limite de concentração com base nas propriedades físico-químicas da proteína e evite concentração excessiva de ração. Para mAbs, a concentração final de rotina geralmente não excede 50 mg/mL; para alguns mAbs-com tendência à agregação, a concentração deve ser reduzida ainda mais.
4. Controle o pH e a condutividade da alimentação
Mantenha um tamanho de partícula hidratado estável da proteína e evite a contração molecular causada por distúrbios de força ácida/base ou iônica.
(B) Equipamentos e controles operacionais
1. Realize testes de integridade do cassete de membrana antes de cada lote
Faça um teste de{0}ponto de bolha antes da produção de cada lote para identificar fibras de membrana quebradas. Cassetes de membrana danificadas devem ser descartadas imediatamente para evitar vazamento contínuo de proteínas.
2. Padronize o procedimento de limpeza CIP
Controle a concentração de NaOH e o tempo de contato. Após a limpeza fortemente alcalina, equilibre totalmente o material da membrana para reduzir o risco de deformação dos poros da membrana.
3. Use diafiltração escalonada
Use uma troca de buffer de grande-volume durante o estágio inicial para remover sais e diminua a taxa de fluxo de diafiltração à medida que o ponto final se aproxima para reduzir o arrasto e a perda de proteínas.
III. Estabelecendo um espaço de design de processo por meio do DOE (caracterização de processo QbD; aplicável ao envio de IND)
1. Triagem de fator
Tela de cinco parâmetros principais do processo UF/DF (P): pressão transmembrana, vazão de alimentação, concentração inicial de proteína, pH de alimentação e temperatura operacional.
Variáveis de resposta: rendimento retido, conteúdo de proteína no permeado, fluxo de membrana e porcentagem de agregados de alto peso-molecular-.
Através da análise de significância, identifique os principais fatores que contribuem para o vazamento de proteínas.
2. Modelagem de superfície de resposta
Selecione os quatro parâmetros com maior significância para construir uma superfície de resposta e analisar as interações entre os parâmetros. Sob muitas condições operacionais, um único parâmetro pode permanecer dentro da sua faixa qualificada, enquanto a combinação de dois parâmetros pode resultar em permeação proteica. Esses efeitos de interação não podem ser identificados por meio de experimentos tradicionais de-fator-de cada-por{5}}tempo. Com base no modelo, defina um espaço de design operável. Desde que os parâmetros do processo permaneçam dentro desta faixa, a retenção eficaz de proteínas pode ser garantida enquanto as impurezas são removidas por diafiltração.
3. Desafio do pior-caso (necessário para caracterização do processo)
Selecione parâmetros de processo nos extremos dos limites operacionais para simular a variabilidade de fabricação: TMP máximo, taxa de fluxo cruzado mínima e limite-superior de concentração de proteína. Verifique se mesmo sob condições operacionais extremas não ocorre perda de proteína alvo em grande-escala, atendendo assim aos requisitos de revisão do CMC.
4. Vários métodos analíticos para identificar proteínas detectadas no permeado e distinguir mAb alvo, fragmentos de degradação e HCP
Com base na eficiência analítica, no custo e nos cenários de submissão regulatória, os métodos podem ser divididos em duas categorias: triagem rápida e testes confirmatórios. Métodos rápidos devem ser priorizados para monitoramento rotineiro de processos; quando ocorrem desvios anormais, devem ser utilizados métodos de identificação precisos.
1. Espectrofotometria UV (triagem on-line rápida; preferida para monitoramento de rotina da loja-)
Recolher o permeado e medir a sua absorvância A280. Isto só pode determinar se a proteína está presente no permeado e não pode distinguir as espécies de proteína. É usado principalmente para monitoramento de processos de rotina. Um valor A280 continuamente crescente indica piora no vazamento de proteínas e requer suspensão imediata da diafiltração e investigação do processo.
2. Eletroforese SDS-PAGE (método de identificação qualitativa mais comumente usado)
Use eletroforese redutora e não redutora e compare as posições da banda com aquelas do mAb alvo na matéria-prima:
1) Se a posição da banda for completamente consistente com o mAb alvo, o mAb intacto permeou a membrana.
2) Se aparecerem faixas de peso-molecular-mais baixo, a proteína sofreu clivagem hidrolítica, gerando fragmentos de mAb.
3) Se as bandas estiverem dispersas com múltiplas bandas diversas, a maioria são proteínas de células hospedeiras (HCPs) de células hospedeiras de E. coli/CHO em vez do produto alvo.
3. Cromatografia de exclusão de-tamanho de alto desempenho-(HPSEC)
Separe os componentes de acordo com o tamanho molecular e compare seus tempos de eluição com os do cromatograma da matéria-prima:
- Um pico principal com o mesmo tempo de retenção do mAb indica proteína alvo intacta.
- Um pico de eluição anterior indica agregados/fragmentos de alto peso-molecular-.
- Um pico eluído posteriormente indica fragmentos de degradação de baixo peso-molecular-.
- A ausência de um pico principal característico indica proteínas de impureza HCP.
Este método pode fornecer dados quantitativos e pode ser incluído em relatórios de investigação de desvios de processo; tem alta aceitação em materiais de submissão clínica.
4. Teste do kit ELISA de proteínas celulares hospedeiras do HCP-
Se a proteína for detectada no permeado, o resultado do ELISA for elevado e o HPSEC não mostrar nenhum pico característico de mAb, o material vazado pode basicamente ser determinado como sendo proteínas da célula hospedeira CHO. Isto indica remoção incompleta de impurezas durante a purificação a montante; as impurezas estão sendo lavadas durante a etapa UF/DF e não representam perda de produto.
5. Verificação de cromatografia de afinidade (cromatografia de proteína A)
A proteína A liga-se especificamente à região Fc dos mAbs. Carregue a amostra de permeado na coluna: o aparecimento de um pico de eluição característico indica a presença de anticorpo alvo intacto; a ausência de um pico de eluição demonstra que as proteínas no permeado são todas proteínas de impureza.
6. Espectrometria de massa (LC-MS) (rastreabilidade-profunda; usada para investigação de grandes desvios do processo)
LC-MS pode analisar diretamente a sequência de aminoácidos e determinar com precisão a origem da proteína. É usado principalmente para investigação de desvios difíceis ou incomuns e não é usado como rotina em-testes de controle de processo.
V. Ações Corretivas Correspondentes a Diferentes Resultados Analíticos
1. mAb alvo intacto detectado no permeado
Reduzir a pressão transmembrana e a concentração final após concentração; estreitar a faixa operacional do processo com base nos resultados do DOE; e verifique a integridade do cassete de membrana.
2. Fragmentos de degradação de anticorpos detectados no permeado
Investigue a tensão de cisalhamento ao longo do processo e os extremos de pH; otimizar a etapa de inativação viral a montante para reduzir a clivagem de proteínas.
3. Somente proteínas de impureza HCP detectadas no permeado
Nenhum ajuste dos parâmetros UF/DF é necessário. Rastreie o problema até as etapas anteriores da cromatografia e melhore a remoção de impurezas durante a cromatografia de afinidade e de{1}troca iônica.
VI. Resumo
Para evitar o vazamento de proteínas durante UF/DF, o controle de processo tradicional depende da experiência histórica para definir parâmetros de pontos individuais, que só podem abordar adequadamente a produção estável em pequena-escala. Para garantir um desempenho estável durante o escalonamento gradual-do processo, a caracterização de processo baseada em DOE-deve ser usada para estabelecer um espaço de design de processo com tolerância suficiente. O controle de parâmetros-baseado em intervalo pode compensar a variabilidade de fabricação. Uma vez detectada a proteína no permeado, um sistema simples de detecção de UV pode fornecer um aviso inicial, seguido por eletroforese, HPSEC e ELISA para rastreabilidade e identificação. Isso permite uma diferenciação precisa entre o produto alvo e as impurezas da célula-hospedeira, possibilitando a investigação-da causa raiz e ações corretivas direcionadas. Este também é um componente de pesquisa padronizado atualmente incluído na documentação do CMC para projetos mAb.
