Precauções para uso do tubo de ultrafiltração
(1) Selecione o tubo de ultrafiltração apropriado. Geralmente, o peso molecular a ser retido não deve ser superior a 1/3 do peso molecular da proteína alvo. Por exemplo, se o peso molecular da proteína alvo for 35kDa, o tubo de ultrafiltração com peso molecular de 10kDa pode ser selecionado. Se o peso molecular da proteína alvo for de cerca de 10 kd, pode ser usado um tubo de ultrafiltração com um peso molecular de 3 kd. Leia atentamente o manual de instruções e preste atenção às diferentes tolerâncias da membrana de ultrafiltração a vários produtos químicos.
(2) A ultrafiltração recém-comprada está seca. Adicione água ultrapura antes de usar e a água passará completamente pela membrana. Pré-resfrie em banho de gelo ou geladeira por alguns minutos. Em seguida, despeje a água e adicione a solução de proteína. A quantidade adicionada não deve exceder a linha branca na parte superior do tubo. A operação deve ser leve. Antes de adicionar a solução de proteína, o tubo de ultrafiltração precisa ser inserido no gelo para pré-resfriamento.
(3) Equilíbrio. Tanto a massa quanto o centro de gravidade devem estar equilibrados. Observe que a velocidade e a aceleração não devem ser muito rápidas, caso contrário, a membrana de ultrafiltração será danificada diretamente. Inicie a ultrafiltração centrífuga (pré-resfriamento da centrífuga a 4 graus). Depois que o RPM de diferentes centrífugas é convertido em G, é diferente. Ajuste a aceleração da centrífuga para a marcha mais baixa para reduzir a pressão na membrana. Observe que você deve esperar até que a centrífuga atinja a velocidade alvo antes de sair da centrífuga, caso contrário, quando houver um problema com a centrífuga, você não poderá lidar com isso na primeira vez. A direção da membrana e do eixo rotativo deve ser ajustada de acordo com as instruções (no caso de centrífuga de rotação angular, a membrana é perpendicular ao eixo). Na prática, a velocidade é geralmente menor que a do manual, o que pode prolongar a vida útil do tubo centrífugo.
(4) Quando estiver concentrado para o 1ml restante, tome 50ul de solução tampão e adicione 10ul para fluir para ver se fica azul, para avaliar se o tubo de ultrafiltração vaza proteína. Se o tubo vazar, despeje a camada superior e flua pelo novo tubo e inicie a ultrafiltração. Para avaliar com precisão se o tubo está vazando, centrifugue com 5mgml de BSA por 10min, depois faça o fluxo, passe cola de proteína ou Bradford para medição aproximada e continue a adicionar a solução de proteína restante para concentração (operar no gelo para evitar que a proteína seja aquecida) até que todas as soluções concentradas sejam adicionadas. Preste atenção se a precipitação de proteína ocorre durante a centrifugação, resultando no bloqueio do tubo. Se ocorrer precipitação, determine a causa específica da precipitação, se a concentração de proteína é muito alta ou se o tampão é inadequado; O primeiro pode ser resolvido por ultrafiltração simultânea com vários tubos de ultrafiltração para reduzir a concentração. O último é mudar diferentes soluções tampão até que a proteína não precipite.
(5) As etapas anteriores são usadas para concentrar a proteína. Se você quiser alterar o tampão, quando a solução de proteína total estiver concentrada para cerca de 1 ml, adicione suavemente um novo tampão (ultrafiltração através da membrana de ultrafiltração 0.22um) e, em seguida, concentre para cerca de 1 ml por três vezes consecutivas. O volume final da última concentração depende da concentração de proteína necessária, que geralmente não é superior a 500ul, ou pode ser concentrada a menos de 200ul. De acordo com a concentração de volume de pelo menos 10 vezes cada vez, pode atingir mais de 1000 vezes três vezes, o que basicamente pode atingir o objetivo de alterar o buffer.
