Aplicação deUltrafiltração emEextração deNnaturalColágeno

 

Ⅰ.O que é colágeno

O colágeno é um biopolímero, o principal componente do tecido conjuntivo dos animais, e também a proteína funcional mais abundante e amplamente distribuída em mamíferos, representando 25% a 30% da proteína total, e até mais de 80% em alguns organismos. Desempenha o papel de tecido de ligação nas células animais.

De acordo com a medição, um adulto possui cerca de 3kg de colágeno em seu corpo, que está presente principalmente na pele, ossos, olhos, dentes, tendões, órgãos internos (incluindo coração, estômago, intestino e vasos sanguíneos) e outras partes. do corpo humano. Sua função é manter a morfologia e a estrutura da pele e dos órgãos, sendo também uma importante matéria-prima para a reparação de tecidos danificados.

II. Extração de colágeno de escama de carpa capim por ultrafiltração

1. Materiais e métodos

1.1 Amostras de teste

Extrato aquoso de colágeno bruto.

1.2 Métodos de teste

1.2.1 Processo de ultrafiltração

1.2.2 Determinação do processo de pré-filtração

Neste teste, o processo ideal de pré-filtração é determinado através da análise comparativa do método de filtração a vácuo e do método de microfiltração. Os métodos de teste específicos são os seguintes:

① O extrato aquoso de colágeno bruto é filtrado por um método de filtração a vácuo de papel de filtro para remover partículas suspensas e impurezas no extrato aquoso.

② O extrato aquoso de colágeno bruto é filtrado com uma membrana de microfiltração de 0 0,2 μm para remover substâncias insolúveis, impurezas, etc.

1.2.3 Escolha do tamanho dos poros da membrana de ultrafiltração

Durante a purificação, o tamanho dos poros da membrana de ultrafiltração é de 100 kDa.

1.2.4 Experimento de fator único do processo de purificação por ultrafiltração

O extrato aquoso de colágeno bruto é purificado por tecnologia de ultrafiltração. Estude o experimento de fator único do efeito da pressão operacional, temperatura operacional e pH na retenção de colágeno. Após iniciar o equipamento de ultrafiltração por um período de tempo, estude o efeito de vários fatores na taxa de retenção de colágeno.

1.2.5 Fórmula de Cálculo

2. Resultados e Análise

2.1 Análise do processo de pré-filtração

Veja a tabela abaixo para os resultados de comparação do método de filtração a vácuo e do método de microfiltração.

Método de Filtragem	Concentração da solução antes da filtração/(g/L)	Concentração da solução após filtração/(g/L)	Fenômenos Sensoriais
método de filtração a vácuo	0.45	0.35	A solução fica límpida no final da filtração, mas torna-se turva após ser deixada por um período de tempo.
método de microfiltração	0.45	0.42	A solução é límpida no final da filtração e permanece límpida após ser deixada por um período de tempo

 

Pode-se observar na tabela que tanto o método de filtração a vácuo quanto o método de microfiltração podem remover as impurezas e sólidos insolúveis da solução, mas o método de microfiltração tem melhor efeito de proteção sobre as proteínas, ou seja, a perda não é significativa, e o método de filtração a vácuo pode causar perdas de proteínas. Além disso, o filtrado fica turvo após ser colocado por um período de tempo por filtração a vácuo, enquanto a microfiltração ainda é límpida e transparente, então a microfiltração é selecionada como o processo de pré-tratamento da ultrafiltração.

2.2 Teste de fator único do processo de ultrafiltração

2.2.1 Efeito da pressão de ultrafiltração na taxa de retenção

Sob a condição de temperatura 40 grau e pH 9.0, estude os efeitos de diferentes pressões de ultrafiltração (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa e 0,15MPa) na taxa de retenção de proteína. Os resultados são mostrados na figura abaixo.

 

Como pode ser visto na figura acima, com o aumento da pressão operacional, a taxa de interceptação da proteína diminuiu gradativamente. Em {{0}}.07MPa, a taxa de retenção de proteína é de 96,53%, quando a pressão operacional é de 0,15MPa, a taxa de retenção de proteína é de 84,38%. Isso ocorre porque a separação de substâncias por ultrafiltração é impulsionada pela diferença de pressão. Nessa faixa de baixa pressão operacional, pequenas substâncias moleculares podem passar rapidamente através da membrana, mas substâncias macromoleculares podem ser retidas pela membrana de ultrafiltração e acumular-se na superfície da membrana e, no momento, na superfície da membrana e no aquoso extrair a diferença de concentração de forma para causar resistência à polarização da diferença de concentração; entretanto, com o aumento da pressão, a resistência à polarização da concentração aumenta gradualmente e a diferença de concentração entre a superfície da membrana e o extrato aquoso atinge o equilíbrio. Quando a pressão excede este equilíbrio, uma camada de gel pode ser escrita na superfície da membrana (o que é consistente com a teoria da polarização da concentração e da camada de gel formada durante a ultrafiltração). A pressão continua a aumentar, a espessura da camada de gel aumenta e a proteína que permanece na superfície da membrana aumenta, resultando em baixa taxa de retenção. Para garantir o efeito de separação da membrana, o parâmetro de pressão operacional ideal é 0,07 MPa.

2.2.2 Efeito da temperatura na taxa de retenção de proteínas

Sob a condição de pressão {{0}}.11MPa, pH 9,0, estude os efeitos de diferentes temperaturas (25 graus, 30 graus, 35 graus, 40 graus e 45 graus) na retenção de proteínas. Os resultados são mostrados na figura abaixo.

 

Conforme mostrado na figura acima, com o aumento da temperatura, a taxa de retenção da membrana de ultrafiltração aumenta gradativamente, atingindo o máximo a 45 graus, sendo a taxa de retenção de 97,01%. Porque a viscosidade do colágeno está intimamente relacionada à temperatura: quando a temperatura é mais baixa, a viscosidade do colágeno é maior e, portanto, o colágeno é fácil de formar resistência na superfície da membrana, resultando em baixa taxa de retenção. Quando a temperatura aumenta, a viscosidade do colágeno diminui e a interação entre as moléculas de colágeno é enfraquecida, de modo que a taxa de transferência de massa aumenta e a polarização da concentração é enfraquecida, aumentando assim a taxa de retenção. Outra razão para o aumento da taxa de retenção é que a temperatura aumenta e a solubilidade do colágeno aumenta correspondentemente, e o fenômeno do bloqueio do colágeno na membrana é reduzido. Portanto, a temperatura ideal para ultrafiltração é de 45 graus.

2.2.3 Efeito do pH na retenção de proteínas

Sob a condição de pressão {{0}}.11MPa e temperatura 40 graus, estude os efeitos de diferentes condições de pH, nomeadamente pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 e pH=10.0, na taxa de retenção . Os resultados são mostrados na figura abaixo.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, a taxa de retenção aumenta gradualmente com o aumento do pH. Isso ocorre porque a membrana de ultrafiltração é uma membrana de bordo de poliéter com carga negativa, colágeno com carga negativa sob condições alcalinas, moléculas de colágeno carregadas negativamente e membrana de ultrafiltração com a mesma carga formam um estado mutuamente exclusivo, de modo que as moléculas de colágeno não são fáceis de permanecer na superfície da membrana, não é fácil bloquear a membrana, então o pH ideal da ultrafiltração é 8-10.

2.3 Otimização do Processo de Ultrafiltração e Validação de Resultados

A análise do software Design-Expert8.{3}}5 mostra que os parâmetros de processo ideais são os seguintes: pressão operacional 00,14MPa, temperatura operacional 40,98 graus e pH da solução=90,43. Nessas condições, a taxa de retenção foi de 92,551%. Considerando a operabilidade dos parâmetros reais, a pressão operacional é de 0,14 MPa, a temperatura operacional é de 40 graus e o valor de pH do líquido de alimentação é 9,50 nas condições de ultrafiltração. A verificação experimental é iniciada após o sistema do dispositivo de ultrafiltração começar a ficar estável. O resultado da taxa de retenção obtido é (92.61 0,1)% (n=3). O valor previsto da equação é basicamente semelhante ao valor medido, o que indica que o resultado do parâmetro condicional previsto está de acordo com o resultado condicional real.

2.4 Resultados da análise de eletroforese

O colágeno purificado é analisado por eletroforese SDS-PAGE e os resultados são mostrados na figura abaixo.

Como mostrado na figura acima, a pista 1 é o colágeno purificado neste experimento e a pista 2 é a amostra padrão de colágeno do tendão da panturrilha. Pode-se observar pela eletroforese SDS-PAGE que a proteína de colágeno proposta neste experimento pode ser identificada como colágeno, mas os limites aparentemente indistintos da cadeia peptídica a1 e da cadeia peptídica a2 não são claros. Fica claro pela eletroforese que não existem outras bandas proteicas e pode-se concluir que a pureza do colágeno purificado é alta.