Aplicação de ultrafiltração na produção de vacina antirrábica humana
A fim de promover a aplicação de ultrafiltração na produção de vacina anti-rábica humana, um cassete de membrana de ultrafiltração de 300kDa foi usado para concentrar a solução de colheita do vírus da raiva e detectar a recuperação de antígeno, taxa de remoção de endotoxina e taxa de remoção de proteína hospedeira após ultrafiltração. Os resultados mostraram que sob a pressão apropriada, a solução de colheita do vírus da raiva foi concentrada 80 vezes, eluída 25 vezes, a taxa de recuperação do antígeno foi de 86,2%, a taxa de remoção de endotoxinas bacterianas foi de 87,5% ~ 88,7%, e a taxa de remoção da proteína hospedeira foi de 91,6%.
Prefácio
A raiva é uma doença zoonótica tradicional e antiga causada pelo vírus da raiva (RV), com uma taxa de letalidade de até 100%. Actualmente, não existe nenhum tratamento eficaz para a pós-exposição (ou seja, danos na pele e nas membranas mucosas), para além da vacina de emergência e da vacinação com imunoglobulina. A principal fonte de raiva em humanos são mordidas de animais doentes ou potencialmente infectados (principalmente cães). A taxa de mortalidade da raiva na China ocupa o segundo lugar no mundo, e a raiva é um dos problemas que ameaçam a segurança da saúde pública no nosso país. A glicoproteína capsular do vírus da raiva, que é o único antígeno chave que induz a produção de anticorpos neutralizantes protetores, tem sido foco de pesquisa e desenvolvimento de novas vacinas e novas tecnologias de diagnóstico e tratamento do vírus da raiva.
O vírus da raiva pertence ao gênero vírus da raiva da família dos rabdovírus. A forma do nucleocapsídeo é elástica, o nucleocapsídeo é helicoidalmente simétrico e a superfície possui um envelope contendo RNA de fita simples. É o patógeno que causa a raiva. O vírus da raiva tem dois antígenos principais: um é o antígeno glicoproteico na membrana externa do vírus, que pode se ligar ao receptor de acetilcolina para tornar o vírus neurotóxico e produzir anticorpos neutralizantes e anticorpos inibidores da hemaglutinação no corpo, e os anticorpos neutralizantes têm um efeito protetor; O outro é o antígeno riboproteico interno, que pode fazer o corpo produzir anticorpos de ligação ao complemento e precipitina, e não tem efeito protetor.
A endotoxina é um tipo de substância lipopolissacarídica (LPS), que possui resistência ao calor e estabilidade química e não é fácil de ser destruída. Se houver uma certa concentração de endotoxina na vacina, causará febre intensa e até morte após a vacinação, portanto o conteúdo de endotoxina na vacina deve ser reduzido tanto quanto possível. A edição de 2005 da Farmacopeia Chinesa (Parte III) determinou que o valor de controle do índice qualificado de endotoxina da vacina antirrábica não deveria ser superior a 100EU/dose. Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de separação por membranas, a aplicação da tecnologia de separação por membranas de ultrafiltração para reduzir o conteúdo de endotoxinas em vacinas está se tornando cada vez mais difundida na indústria farmacêutica.
Uma vacina contra a raiva é uma vacina contra a raiva. Geralmente existem três tipos de vacinas contra a raiva, incluindo vacina de células Vero purificadas, vacina de células diplóides humanas e vacina de cultura de células primárias. A vacina anti-rábica é feita inoculando o vírus fixado pelo vírus da raiva na matriz celular, após cultura, colheita, concentração, inativação, purificação e adição de estabilizador apropriado. A principal função da vacina anti-rábica é estimular o organismo a produzir uma resposta imunológica rápida e produzir anticorpos protetores contra o vírus da raiva, de modo a prevenir a infecção causada pelo vírus e reduzir o risco de doença.
O processo de produção da vacina desempenha um papel importante na garantia da qualidade da vacina, especialmente a quantificação de alguns indicadores no processo de produção é mais importante. No processo de produção da vacina anti-rábica humana, a tecnologia de concentração de ultrafiltração é um meio necessário para produzir a vacina anti-rábica humana. O uso de membrana de ultrafiltração com abertura razoável para concentração de ultrafiltração pode remover efetivamente a endotoxina e a proteína do hospedeiro e reter o antígeno RV, o que favorece a produção de vacinas e a melhoria da qualidade. A massa molecular relativa das moléculas de RV é de 350kDa ~ 460kDa e, em teoria, o RV pode ser completamente aprisionado por concentração de ultrafiltração usando cassete de membrana com peso molecular de interceptação de 100kDa e 300kDa. A endotoxina freqüentemente forma estrutura agregada em diferentes soluções aquosas, devido ao grau de agregação, o tamanho molecular é diferente. A massa molecular relativa do monômero de endotoxina é de 10kDa ~ 20kDa, e a massa molecular relativa de sua forma de polimerização é de 300kDa ~ 1000kDa ou mais de 1000kDa. Com base na diferença de peso molecular, o antígeno RV na vacina anti-rábica humana foi retido e a endotoxina e a proteína hospedeira na vacina anti-rábica humana foram removidas por membrana de ultrafiltração de 300 kDa.
Neste experimento, um cassete de membrana de ultrafiltração com abertura de 300kDa e área de membrana de 0,11m2 foi usado como tratamento de pequenas amostras para concentrar produtos intermediários da vacina anti-rábica humana e fluxo de membrana, eficiência de tratamento, concentração múltipla, interceptação de antígeno, remoção de endotoxina e a remoção da proteína hospedeira foram testadas.
2Método Material
2.1 Materiais experimentais
Cepa CTN-IV do vírus fixo do vírus da raiva; Células Vero; 0hidróxido de sódio 0,5M; Cassete de membrana de ultrafiltração de 300kDa (material PES, área de membrana de 0,11m²).
2.2 Métodos experimentais
2.2.1 Preparação de solução de colheita de vírus
Células Vero congeladas foram ressuscitadas em água morna a 37 graus ~ 39 graus, a suspensão celular foi sorvida e depois adicionada ao meio de cultura 199 contendo 10% de soro de bezerro inativado. Células em monocamada uniformes foram cultivadas a 37 graus. A cepa CTN-IV foi inoculada com vírus da raiva em uma proporção de 0,1mol/L e cultivada a 37 graus. Após 48h, o meio de cultura foi descartado e foi adicionado meio de cultura 199 contendo 0,1% de albumina de sangue humano para manter a cultura a 33 graus ~ 35 graus. Colha o veneno da doença uma vez a cada 3d-5d e combine os vários fluidos de colheita.
2.2.2 Instalando o Cassete de Membrana
Instale o cassete de membrana e conecte a fiação conforme mostrado na figura abaixo.
2.2.3 Lavagem com Água
Feche a válvula de entrada, a válvula de retorno e a válvula de passagem e insira a extremidade de retorno e o tubo da extremidade de passagem no tanque de líquido residual. Encha o tanque de entrada com 1L de água para injeção.
Abra as válvulas de entrada e retorno, feche as válvulas de passagem, abra a bomba, limpe a linha de retorno com 10% do volume de água purificada ou água para injeção e mantenha a pressão de entrada em 0,35bar (5psi).
Abra a válvula do filtro, feche a válvula de retorno e use o restante da água de injeção para limpar o tubo do filtro, mantendo o TMP em 0,35bar.
2.2.4 Desinfecção
Feche a válvula de entrada, a válvula de retorno e a válvula de transmissão e insira as linhas da extremidade de retorno e da extremidade de transmissão no tanque de líquido residual. Encha o tanque de entrada com 2L de solução de limpeza.
Abra as válvulas de entrada e retorno, feche as válvulas de passagem, abra a bomba, limpe a linha de retorno com 200mL de hidróxido de sódio 0,5M e mantenha a pressão de entrada em 0,35bar (5psi) .
Abra a válvula de passagem, feche a válvula de retorno e limpe o tubo de passagem com um volume de 200mL de solução de limpeza, mantendo o TMP em 0,35bar.
Em seguida, a extremidade de retorno e o tubo final são inseridos no tanque de líquido para limpeza cíclica. Faça um ciclo de limpeza com 1 ~ 1,5 vezes a vazão tangencial do processo por 30 minutos.
Drene 00,5M de hidróxido de sódio e enxágue com água para preparações injetáveis de acordo com 2.2.4 até ficar neutro.
2.2.5 Teste de fluxo de água
Adicione água purificada ao tanque de entrada, meça e registre a temperatura da água no tanque de entrada. Insira a extremidade de retorno no tanque. Ligue a bomba e ajuste a velocidade da bomba e a válvula de retorno para obter uma diferença de pressão transmembrana de 00,35bar (5psi). Usando um cilindro, meça e registre a vazão na extremidade em mL/min. Ajuste a velocidade da bomba e a válvula de retorno para obter pressão diferencial transmembrana de 1bar (15psi). Usando um cilindro, meça e registre a vazão na extremidade em mL/min.
Para padronizar o valor do fluxo de água, divida o valor calculado do fluxo de água pela diferença de pressão transmembrana e multiplique o fator de correção de temperatura na tabela a seguir.
2.2.6 Concentração de ultrafiltração
Lave a água do sistema com a tampa do buffer. Ciclo por 5min para ajustar o pH e a estabilidade iônica do sistema. Se a temperatura precisar ser ajustada, continue o ciclo até que a temperatura do sistema esteja estável.
Adicione o líquido de alimentação ao tanque de entrada, defina uma taxa de fluxo de alimentação (por exemplo, 400LMH) e teste a taxa de fluxo em diferentes valores de TMP. De acordo com os dados do teste, foram traçadas curvas com TMP como abscissa e Flux como ordenada.
Direcione o tubo de passagem para um recipiente ou dreno adequado, como tanques de coleta de passagem, tanques de resíduos líquidos e drenos de processo.
Registre o peso inicial do líquido de alimentação no tanque de alimentação, ligue a bomba de alimentação e circule lentamente o líquido de alimentação por 3 a 4 minutos. A recirculação pode ajudar a remover o ar residual no caminho do fluxo, maximizando assim o desempenho do filme.
Abra a válvula de passagem, aumente lentamente a velocidade da bomba até atingir a vazão tangencial ideal e ajuste a válvula de retorno para atingir o TMP ideal do sistema.
Em seguida, coloque o tubo no recipiente de coleta, comece a cronometrar quando o líquido entra no recipiente e registre a pressão de entrada e retorno em intervalos apropriados e registre a qualidade do líquido ao longo do tempo na extremidade de retorno e na extremidade de passagem para calcular o instantâneo quociente de vazão.
A concentração de ultrafiltração da amostra é completada quando o volume líquido da alimentação é reduzido ao volume de concentração alvo.
2.2.7 Diálise
Coloque o tubo de entrada, o tubo de reabastecimento e o tubo de retorno no tanque de entrada, coloque o tubo de transmissão no recipiente de coleta e coloque o recipiente de coleta na balança para limpar.
Abra a válvula de retorno, ligue a bomba de entrada, abra a válvula de passagem, ajuste a velocidade da bomba e o TMP para o valor apropriado. Abra a bomba de reabastecimento, mantenha inalterado o volume de líquido no tanque de admissão e inicie a diálise de volume igual. Comece a cronometrar quando o líquido entra no recipiente e registre a pressão na extremidade de entrada, na extremidade de retorno e a massa do líquido no intervalo de tempo apropriado e obtenha a vazão instantânea por cálculo.
2.2.8 CIP
Primeiro enxágue com tampão, depois enxágue com água para injeção (operação 2.2.3), depois limpe com agente de limpeza (operação 2.2.4) e, finalmente, enxágue com água para injeção (operação 2.2.3).
2.2.9 Teste de fluxo de água
A operação é a seguinte: 2.4.5.
2.2.10 Preservação do cassete de membrana
Armazenamento de curto prazo (menor ou igual a 3 dias), mantenha o cassete de membrana no dispositivo e use a solução de armazenamento para fazer um ciclo de 10 minutos a 15 minutos, feche a válvula do sistema, corte a fonte de alimentação da bomba de líquido e garanta que o tanque de entrada de líquido esteja corretamente vedado.
Se o tempo de armazenamento for de 3 dias a 1 mês, remova o cassete de membrana do aparelho e feche-o em um saco plástico ou outro recipiente hermético. Adicione cerca de 50mL a 100mL da solução de armazenamento em um saco plástico ou recipiente hermético e feche-o. Ou pode ser imerso diretamente na solução de armazenamento. A tabela a seguir recomenda condições de armazenamento.
3 Resultados e análises
3.1 Investigação dos fatores que influenciam a eficiência da remoção de pirogênios
Pressão de operação de ultrafiltração: 15 lotes de teste foram executados continuamente. Em cada lote, a pressão de filtração foi mantida a 5, 10, 15 e 2{{10}}psi durante a ultrafiltração, e o líquido de colheita de vírus foi concentrado 30 vezes e eluído com líquido tampão (10 vezes o volume) em fluxo contínuo. Resultados conforme mostrado na tabela abaixo, a taxa de remoção da endotoxina foi inferior a 87,0%, a taxa de recuperação do antígeno foi estável em 86,0% e a taxa de remoção da proteína hospedeira foi estável em 90,0%, indicando que diferentes pressões operacionais tiveram pouca influência no efeito da recuperação do antígeno, remoção de endotoxinas e remoção de proteínas do hospedeiro.
Razão de concentração de ultrafiltração: 15 lotes de teste foram executados continuamente. Em cada lote, o líquido de colheita de vírus foi concentrado 30 vezes, 50 vezes, 80 vezes e 100 vezes, respectivamente, durante a ultrafiltração. A pressão de filtração foi mantida a 20 psi e o líquido tampão (10 vezes o volume) foi eluído em fluxo contínuo. Resultados conforme mostrado na tabela a seguir, a taxa de remoção de endotoxina variou de 53,3% a 86,9%, a taxa de recuperação de antígeno permaneceu estável em 86,0%, e a taxa de remoção de proteína hospedeira ficou estável em 91,0%. Na amostragem segmentada, nenhum antígeno foi detectado na solução de transmissão e menos de 10% da proteína hospedeira permaneceu na solução concentrada de vírus. A concentração de endotoxina na solução concentrada de vírus aumentou com o aumento dos tempos de concentração, e a taxa de remoção de endotoxina foi a maior na amostra concentrada de 80 vezes, e o fabricante também pôde considerar a concentração de 100 vezes, o que não só melhorou a eficiência da produção e reduziu o custo, mas também atendeu aos requisitos de produção de vacinas.
3.2 Esgotamento do fluxo do cassete de membrana e regeneração de limpeza
Após o tratamento, a taxa de recuperação do fluxo da membrana foi de 92,6%. A primeira taxa de recuperação do novo cassete de membrana é normal, de acordo com as propriedades de observação atuais do líquido de alimentação, a previsão subsequente do segundo tempo e do NTH, a taxa de recuperação do fluxo do cassete de membrana estará próxima dos dados após este tratamento, e tendem a ser estáveis. Dentro de 2 horas de uso único, o esgotamento do cassete de membrana foi ideal e apenas 10% do fluxo da membrana foi esgotado durante a operação geral.
3.2.1 Esgotamento de fluxo no processo de tratamento de cassete de membrana
3.2.2 Resultado da limpeza e regeneração do cassete de membrana
Sobre Guidling
A Guidling Technology é uma empresa nacional de alta tecnologia com foco em produtos biofarmacêuticos, cultura celular, purificação e concentração de biomedicina, diagnóstico e fluidos industriais. Desenvolvemos com sucesso dispositivos de filtro centrífugo, cassetes de ultrafiltração e microfiltração, filtro de vírus, sistema TFF, filtro de profundidade, fibra oca, etc. Nossas membranas e filtros de membrana são amplamente utilizados em concentração, extração e separação de pré-filtração, microfiltração, ultrafiltração e nanofiltração. Nossas diversas linhas de produtos, desde filtração laboratorial pequena e descartável até sistemas de filtração de produção, testes de esterilidade, fermentação, cultura celular e muito mais, atendem às necessidades de testes e produção. A Guidling Technology está ansiosa para cooperar com você!
