Vacina de partículas do tipo vírus e seu processo de purificação a jusante

A vacina contra partículas do tipo vírus (VLP) é uma tecnologia de vacina que se baseia na estrutura do vírus, mas não contém os materiais genéticos virais. Eles estimulam uma forte resposta imune, imitando a morfologia e os antígenos da superfície dos vírus naturais e proporcionam maior segurança devido à sua incapacidade de replicar. As vacinas contra a VLP são uma alternativa melhor às vacinas tradicionais (atenuadas e inativadas ao vivo). A vacina contra a VLP não pode se replicar no corpo, por isso é adequado para todos, incluindo mulheres grávidas ou aqueles com sistemas imunológicos comprometidos. Além disso, as proteínas do capsídeo (incluindo outras proteínas estruturais) de vírus com genomas segmentados, como vírus da influenza, vírus da doença de cavalos africanos e vírus de bluetonos, também podem ser usados ​​para desenvolver vacinas VLP sem se preocupar com questões de recombinação genética, como vacinas vivas. Segundo, os VLPs são capazes de imitar a estrutura de vírus reais, diferentemente das vacinas inativadas, cujas proteínas estruturais podem ser modificadas durante a inativação, resultando em comprometimento imunogênico.

 

FIGO. 1. Mecanismo de formação de VLPs e VLPs quiméricos

 

Características da vacina VLP

1. Estrutura semelhante aos vírus naturais: os VLPs são auto-montados por uma ou mais proteínas estruturais (como proteínas do capsídeo), e seu tamanho e forma são semelhantes aos vírus reais.

2. Não infeccioso: não contém o genoma viral, não pode replicar ou causar doenças.

3. Alta imunogenicidade: a estrutura granular pode ser reconhecida pelo sistema imunológico com eficiência e ativar as respostas das células B e das células T. Pode induzir anticorpos neutralizantes e imunidade celular (por exemplo, vacinas contra o HPV).

4. Alta Segurança: Adequado para pessoas com baixa função imunológica (como a vacina contra a VLP da hepatite B).

 

FIGO. 2. Vacinas VLP disponíveis

 

Sistema de produção de vacina VLP

Os VLPs podem ser produzidos através de uma variedade de sistemas de expressão, as plataformas comuns incluem:

 

1. Sistema de celular-baculovírus de insetos:

Vantagens: alto rendimento, baixo custo, adequado para montagem complexa de proteínas.

Aplicação: vacina contra o HPV, vacina contra o Ebola.

 

2. Células de mamíferos (por exemplo, células HEK293):

Vantagens: As modificações pós-traducionais estão mais próximas dos seres humanos e adequadas para VLPs envolvidos (como vacinas contra a gripe).

 

3. Sistemas de levedura (por exemplo, Pichia pastoris):

Vantagens: Rápido, baixo custo, tem sido usado na vacina contra a hepatite B.

 

4. Sistemas vegetais (por exemplo, cloroplastos de tabaco):

Ambientalmente amigável e escalável, em desenvolvimento (por exemplo, vacina contra VLP de norovírus).

 

Processo de purificação a jusante da vacina contra VLP

A diversidade dos sistemas de expressão de VLPs leva à inuniversalidade dos processos de purificação a jusante.

 

 

FIGO. 3 Um fluxograma de processo geral a jusante

 

Colheita e esclarecimento:

Em todos os tipos de meio de cultura, prop, há um grande número de partículas de vírus, bem como muitos detritos de tecido celular, produtos metabólicos e outras impurezas, tornando a cultura média nublada ou semi-cloudy, se a concentração de cultura não pode ser concluída e a suma de que a concentração não pode ser concluída. Portanto, deve ser esclarecido primeiro antes da concentração, para remover as grandes partículas no meio de cultura, para que se torne uma solução translúcida ou transparente, e a concentração do meio de cultura pode tornar o processo de concentração normal e garantir a vida útil da membrana de ultrafiltração. O esclarecimento antes da concentração da solução de cultura é um vínculo técnico essencial no processo de concentração.

 

Um processo de esclarecimento eficiente requer uma combinação de alta capacidade para remover partículas sólidas, alto rendimento do produto, fácil expansão e proteção para unidades operacionais a jusante.

 

Método

Centrifugação: A centrifugação diferencial remove grandes partículas.

Filtração profunda: use um filtro de vários estágios (por exemplo, 1,2μm → 0. 45μm) para esclarecer o sobrenadante.

Filtração de fluxo tangencial (TFF): Adequado para a produção em massa, concentra amostras e remove pequenas partículas de impurezas.

 

No entanto, se a escala de cultivo for muito grande, a centrifugação levará muito tempo, será necessário um grande número de membranas de filtro profundo, para que o custo dos consumíveis aumente bastante. Ao mesmo tempo, a alta densidade da cultura celular reduzirá a carga da membrana do filtro profundo, resultando em aumento de custos e diluição excessiva do produto.

 

Existem dois tipos de componentes da membrana TFF: cassete plano e fibra oca. A filtração de fluxo tangencial (TFF) é acionada pela diferença de pressão transmembranar. Substâncias e impurezas menores que o poro da membrana passam pela membrana, enquanto impurezas como células com partículas maiores estão presas. O tamanho dos poros da membrana usado para microfiltração é {{0}}. 45/0,22μm. A fibra oca pode processar um alto teor sólido líquido diretamente, como meio de cultura de células de alta densidade, pode eliminar as etapas de centrifugação e pré-filtração, menos etapas, operação simples, membrana pode ser usada repetidamente através da limpeza, redução do investimento em equipamentos e custos operacionais, alinhados com os requisitos da produção automatizada modular.

 

Concentração de ultrafiltração (TFF):

Alvo: reduzir a quantidade de tratamento cromatográfico, melhorar a eficiência cromatográfica e proteger a coluna cromatográfica.

Em geral, a ultrafiltração (TFF) pode se concentrar mais de 100 vezes de VLP, e a taxa de remoção de heteropoteína pode atingir 99%. Entre eles, a tecnologia de filtração da membrana de fibra oca tem as vantagens de força de cisalhamento leve e baixa, não é fácil de conectar, operação flexível, vida útil longa, baixo custo e amplificação fácil, por isso é recomendável escolher fibra oca para VLP concentrado e purificado.

 

Quando o método de ultrafiltração é usado para concentração e purificação, é muito importante selecionar o tamanho certo do poro da membrana, que determina a eficiência e a qualidade da concentração diretamente. Por um lado, é necessário selecionar a abertura da membrana para prender efetivamente as moléculas alvo para garantir o rendimento e, por outro lado, o efeito de remoção e a velocidade de processamento das heteropoteínas devem ser totalmente considerados. Portanto, o melhor princípio é selecionar a membrana com o maior tamanho de poro que pode prender a molécula de destino e tentar selecionar a membrana do filtro com distribuição uniforme de tamanho de poros.

 

Purificação primária:

1. Método de precipitação

Precipitação de polietileno glicol (PEG): a precipitação seletiva dos VLPs requer concentração otimizada de PEG e concentração de sal para equilibrar o rendimento e a pureza.

 

2. Cromatografia

Cromatografia de Affinity:

Afinidade da heparina: usando propriedades VLPs da carga negativa da superfície (por exemplo, HPV VLP).

Cromatografia de acoplamento de anticorpos: alta especificidade, mas cara.

Cromatografia em troca iônica (IEX): Escolha troca ânion (por exemplo, coluna Q) ou troca de catátio (por exemplo, coluna SP), dependendo das características da carga da superfície do VLP e otimize o gradiente de pH e sal para evitar a agregação de partículas.

Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC): com base na hidrofobicidade da superfície dos VLPs, adequada para alguns VLPs não encapsulados.

 

Purificação fina:

Cromatografia de exclusão molecular (SEC, filtração em gel):

Remoção de proteínas hospedeiras residuais, ácidos nucleicos ou agregados, acompanhados por substituição de tampão. Alta resolução, mas baixo fluxo, geralmente usado como a etapa final do refinamento.

 

Cromatografia multimodo:

Por exemplo, as resinas da série Capto Core, combinadas com troca iônica e efeito de peneira molecular, podem remover uma variedade de impurezas em uma etapa.

 

Inativação do vírus/remoção de ácido nucleico (se necessário):

Tratamentos de nuclease: como o DNA/RNA do hospedeiro de degradação da benzonase.

UF/DF: Coordenando o sistema TFF para remover pequenos fragmentos de ácidos nucleicos e enzimas.

 

Concentração e preparação:

Filtração de fluxo tangencial (TFF):

Concentre -se nos títulos de alvo enquanto desloca os buffers (como PBS ou buffers de formulação).

 

Filtração estéril:

0. 22μm A filtração da membrana garante esterilidade.

 

Caso típico

A seguir, são apresentados os processos de purificação a jusante para vacinas típicas da VLP.

 

 

Sobre orientação

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