Estudo sobre a capacidade de eliminação de vírus do processo downstream de anticorpos monoclonais

Os produtos biotecnológicos derivados de linhas celulares podem estar em risco de contaminação por vírus – a extensão depende de uma série de factores, incluindo a fonte de preparação, as matérias-primas utilizadas, o sistema de produção, os reagentes de purificação e os excipientes. Estudar a remoção ou inativação de vírus no processo de fabricação é um passo fundamental para reduzir o potencial de transmissão iatrogênica de vírus patogênicos e, assim, reduzir o risco, o que é essencial para a segurança dos produtos. Antes que os produtos biológicos possam entrar em ensaios clínicos e serem comercializados, deve ser demonstrado que o seu processo de produção tem a capacidade de remover vírus conhecidos e presumidos.

 

01 Avaliação de segurança de vírus de produto de anticorpo monoclonal

A pesquisa sobre a capacidade de remoção de vírus geralmente consiste na adição do vírus indicador de título conhecido ao produto intermediário em diferentes estágios de produção, em seguida, na determinação do título de vírus residual na amostra tratada por um processo específico e, finalmente, na avaliação do valor de redução logarítmica (LRV) do título do vírus. As etapas do processo para LRV maiores ou iguais a 4log10 são geralmente consideradas etapas eficazes de remoção de vírus. O processo com LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

Ao usar o método de processo de produção simulado (processo reduzido), é necessário projetar um plano razoável de pesquisa e teste de remoção/inativação de vírus relacionado ao processo de produção real, tanto quanto possível, especialmente as etapas eficazes do processo de produção. O processo simulado deve ser estritamente consistente com o processo real em termos de parâmetros de teste e condições de controle.

 

02 Geralmente indica vírus e esquemas de verificação

Os vírus indicadores comuns são mostrados na Tabela 1.

Na fase de aplicação experimental de novos medicamentos (IND), um produto biotecnológico requer estudos de eliminação viral para pelo menos 2 vírus modelo, normalmente selecionando um retrovírus (X-MuLV) e um parvovírus (MMV). Durante a fase de solicitação de licença biológica (BLA), estudos de remoção de vírus são normalmente conduzidos usando 3-5 vírus específicos/não específicos e 3-5 etapas do processo são avaliadas para demonstrar que o produto tem um fator de segurança adequado de um perspectiva de segurança contra vírus. Devido às diferentes diretrizes nacionais e estrangeiras, existem algumas diferenças nas etapas de verificação de eliminação de vírus usadas para declarações. Os esquemas de verificação de eliminação de vírus comumente usados ​​no processo de produção de mAb são mostrados na Tabela 2.

 

03 Capacidade de remoção de vírus de processos downstream

3.1 A capacidade dos processos downstream de remover diferentes vírus

A partir de 2009, produtos de anticorpos monoclonais submetidos ao FDA para IND e BLA, cromatografia de afinidade de proteína A, pH baixo, cromatografia de troca aniônica AEX (modo de penetração de fluxo), cromatografia de troca catiônica CEX (modo de ligação - eluição) e validação de eliminação de vírus excluindo filtração de vírus são as famílias de vírus indicadores mais comumente usadas e a média e o intervalo de seus efeitos de eliminação são mostrados na Figura 1.

Para os retrovírus, com exceção do CEX, que possui um LRV de cerca de 3log10 (conforme mostrado no gráfico de barras A da Figura 1), os demais processos foram robustos (LRV maior ou igual a 4log10). Herpesvírus e retrovírus têm efeitos de eliminação semelhantes e LRV > 4log10 (conforme mostrado no gráfico de barras B na Figura 1). Pequenos vírus sem envelope, como o parvovírus, são mais difíceis de remover eficazmente, são resistentes ao tratamento químico e não são facilmente capturados por filtros (mostrado no gráfico de barras C na Figura 1). Apenas filtros AEX e pequenos vírus foram eficazes na remoção de parvoviridae (LRV médio > 4log10).

Os processos mostrados na Figura 1 são Proteína A, AEX (modo de penetração de fluxo), CEX (modo de eluição de conjugação), inativação de pH baixo (remoção "incompleta" versus "completa") e filtração de vírus de grande e pequena abertura.

 

3.2 Fatores que influenciam os processos downstream na capacidade de remoção de vírus

A distribuição dos valores de LRV para cada processo é mostrada na Figura 2. Os estudos com 0 ~ 21og10 foram classificados como grupo de LRV baixo, e aqueles com mais de 6log10 foram classificados como grupo de LRV alto para análise comparativa.

 

3.2.1 Cromatografia de afinidade com Proteína A

Não houve correlação significativa entre o valor LRV do processo de Proteína A e o equilíbrio/tampão de lavagem, carga, composição do eluente e valor do pH da eluição. O denominador comum do grupo de baixo LRV é que a matéria-prima é bastante complexa e pode ser que a interação complexa da matéria-prima e da carga afete negativamente a capacidade da coluna cromatográfica de remover vírus.

 

3.2.2 AEX (modo de fluxo)

Strauss et al. mostraram que o pH e a condutividade das amostras AEX podem afetar o LRV. Porém, os resultados estatísticos de Miesegaes et al mostraram que, semelhante à Proteína A, o LRV do AEX (modo de penetração de fluxo) não teve correlação significativa com diferentes tampões, cargas, pH e condutividade, o que pode ser devido à otimização do pH e condutividade nas condições do processo do caso relatado.

 

3.2.3 CEX (Ligação - Modo de Eluição)

A remoção de vírus pelo processo CEX não é robusta o suficiente. Não houve correlação significativa entre o LRV no grupo de alto LRV e o tampão, o nível de experiência ou quaisquer propriedades da coluna cromatográfica, como altura da coluna e tipo de resina. No entanto, os valores de equilíbrio/carga e pH de eluição utilizados no estudo de alto LRV foram ambos mais baixos, 5,3±0,2; No grupo LRV baixo, o pH foi 6,0±0,2. Outro fator é que a concentração de sal no tampão também pode causar a diferença no valor do LRV. O tampão utilizado no estudo de baixo LRV apresentou maior concentração de sal, com concentração média de 290±120 mM na solução de carga/balanceamento e 340±70 mM no eluente, enquanto as concentrações de NaCl no estudo de alto LRV foram de 58 ± 27 mM e 183 ± 31 mM, respectivamente.

 

3.2.4 Inativação de pH baixo

No processo de pH baixo, o pH é um parâmetro chave do processo, e um pH de 3,8 é suficiente para inativar o retrovírus em grau. O grupo de baixo LRV teve pH de 3,9, enquanto o estudo de alto LRV teve pH de 3,4.

 

3.2.5 Removendo filtragem de vírus

Para filtros de abertura pequena e grande, o valor LRV da remoção de MuLV não foi inferior a 2log10, e apenas 1% dos estudos ficaram abaixo de 3log10 (mostrados nas colunas h e i na Figura 2). A eliminação global de retrovírus por filtros de vírus de grande abertura foi inferior à dos filtros de vírus de pequena abertura (como mostrado no gráfico de barras C na Figura 1). O principal motivo que afeta o resultado da remoção do parvovírus são os diferentes tipos de filtros. Em geral, a filtragem antivírus pode remover vírus de forma confiável.

Os processos são Proteína A (a), modo de penetração AEX (b), ligação CEX - modo de eluição (c), ligação AEX Ⅰ modo de eluição (d), inativação de baixo pH ("incompleta" e "completa" depuração)(e ~ g), e tamanho de poro grande (h) e tamanho de poro pequeno (i ~ j) filtração de vírus (onde, a ~ i: Retrovírus; j: Parvovírus).

 

04 Inovações e desafios na avaliação de segurança antivírus

O desenvolvimento e a inovação contínuos no campo dos processos biofarmacêuticos a jusante trarão inevitavelmente inovações na avaliação da eliminação de vírus. Os avanços nos processos a montante e a jusante, como os bioprocessos de fluxo contínuo, tornaram necessário avaliar e estabelecer processos eficazes e robustos de remoção de vírus. Durante o fluxo contínuo, ainda se espera que etapas como inativação de vírus e filtragem de vírus sejam realizadas em modo lote. Embora a capacidade de remoção de vírus dos processos cromatográficos em modo de fluxo contínuo não deva ser substancialmente diferente daquela do processamento em lote, ela deve ser apoiada por dados.

 

05 Perspectivas

Do ponto de vista da segurança virológica, a excelente segurança da indústria biofarmacêutica pode ser atribuída em grande parte à adesão estrita da indústria a três estratégias principais para a segurança viral: fornecimento e testes adequados de fontes de materiais e bancos de células, documentação de avaliações de eliminação viral (estudos de validação de vírus) e testes virais em processo. As características dos medicamentos biológicos produzidos por novos substratos celulares podem mudar com diferentes riscos, e são necessárias boas estratégias de gestão de riscos para garantir a segurança dos medicamentos biológicos. A Guidling Technology possui uma equipe técnica profissional experiente, cobrindo o processo de filtração desde pequenos testes, testes piloto até produção em larga escala. Nossos filtros de membrana e membrana são amplamente utilizados em pré-filtração, microfiltração, ultrafiltração, concentração de nanofiltração, extração e separação; Nossas diversas linhas de produtos, desde pequenas filtrações laboratoriais de uso único até sistemas de filtração orientados à produção, testes de esterilidade, fermentação, cultura de células e muito mais, garantem maior produtividade.

Jiuling para garantir a qualidade do produto como o primeiro indicador, na busca de "reduzir custos, aumentar a eficiência" no caminho a explorar, ansioso para trabalhar com você no futuro para enfrentar os desafios da indústria e buscar um melhor desenvolvimento.