Estudo sobre a aplicação de filtração profunda no processo de produção de vacina contra febre aftosa
Prefácio - O que é febre aftosa
No século XIV, existem registos escritos de febre aftosa semelhante na Europa. A febre aftosa é uma doença aguda, febril e altamente contagiosa, causada pelo vírus da febre aftosa.
Os sintomas clínicos dos animais adultos incluem: aumento da temperatura corporal, bolhas e ulcerações na boca, bolhas e ulcerações no casco e até queda da casca do casco, causando dificuldade para comer e dormir, perda de peso e até perda de valor econômico em animais econômicos. ;
Os sintomas clínicos de animais jovens incluem: temperatura corporal elevada, miocardite e outros sintomas, uma vez iniciados, os animais jovens apresentam alta mortalidade.
Resumo
Nos últimos 500 anos, a febre aftosa eclodiu repetidamente em todo o mundo, e um grande número de porcos, bovinos, ovinos e outros animais domésticos e ungulados selvagens de dedos iguais morreram ou adoeceram, afetando gravemente a pecuária. e indústria de criação.
A fim de estudar a aplicação da tecnologia de filtração profunda no processo de produção de vacina contra febre aftosa, o desempenho da filtrabilidade da filtração superficial e da filtração profunda foi testado e comparado, bem como o efeito protetor na filtração bactericida. As vantagens da filtração profunda de alta carga na remoção de detritos celulares foram estudadas. Os esquemas de filtração correspondentes para meio de cultura celular com turbidez diferente foram analisados.
Os resultados mostraram que a carga de filtração profunda foi 13,9 vezes maior que a da filtração superficial, a turbidez do líquido do filtro foi de apenas 23,5% da filtração superficial e a carga de desbacterialização subsequente de 0 0,2um foi 7,2 vezes maior que a do filtração de superfície. Ao usar seu ligante de resina especial, a turbidez do líquido do filtro é 38,6% daquela do filtro profundo comum com o mesmo tamanho de poro, o que é benéfico para proteger o processo a jusante. Os resultados mostraram que a filtração profunda, especialmente a filtração profunda com carga positiva forte, poderia ser efetivamente aplicada à produção de vacina contra a febre aftosa, e processos de filtração adequados deveriam ser estabelecidos para diferentes meios de cultura.
Febre aftosa e filtração profunda
A febre aftosa (FA) é uma doença aguda, febril e contagiosa de animais de casco fendido, causada pelo vírus da febre aftosa (FA). Os animais mais suscetíveis a esta doença incluem bovinos, suínos e ovinos. A febre aftosa é endémica na Ásia, África, Médio Oriente e América do Sul, com uma incidência muito elevada e uma transmissão rápida. A Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) lista-a como a primeira doença zoonótica da categoria A, exigindo que os Estados-Membros incluam a febre aftosa na lista de doenças animais de notificação obrigatória. A vacinação é um meio eficaz de prevenção específica da febre aftosa. A vacina inativada contra a febre aftosa, que é produzida pela inativação do vírus intacto com inativador, desempenha um papel importante na prevenção e controle da febre aftosa.
A antigenicidade do FMDV em si é baixa e a inativação do vírus tem um grande impacto no seu antígeno. Portanto, na produção atual da vacina contra a febre aftosa, a vacina contra a febre aftosa de alta pureza pode garantir o conteúdo de antígeno e a pureza da dose unitária, o que é particularmente importante e é também a atual estratégia de vacinação. Isto apresenta requisitos elevados para a purificação a jusante de vírus. Além disso, antes de 2009, o fluxo de vacinas inativadas contra a febre aftosa na China adotava principalmente o método de cultura de girar a garrafa e colar na parede. Com a crescente demanda por vacinas, surgiram gradativamente as desvantagens desse método de cultura que requer um grande número de frascos rotativos, baixa eficiência e baixo nível de expressão.
Portanto, nos últimos anos, a tecnologia de cultura celular mudou lentamente da cultura aderente anterior para a cultura em suspensão, e a produção de vírus melhorou significativamente. No entanto, com o aumento da produção de vírus, a mudança no modo de cultura trouxe maior pressão para a purificação a jusante, porque os detritos celulares gerados pelo processo de cultura, a liberação celular de proteínas hospedeiras, DNA hospedeiro, etc., aumentaram correspondentemente, o que impõe requisitos adicionais à capacidade de purificação a jusante.
A tecnologia de filtração por membrana é amplamente utilizada no processo de produção de produtos biológicos, como vacinas, entre os quais a tecnologia de filtração DC é geralmente usada no processo de colheita de veneno de doenças para separar impurezas insolúveis, como restos celulares. No esclarecimento inicial do FMDV, a tecnologia de filtração de superfície representada pelo elemento filtrante de membrana dobrável foi adotada principalmente. Com a mudança das condições de cultura, o aumento de impurezas de detritos celulares, a filtração superficial é difícil de alcançar o efeito de clarificação e, como a carga de filtração superficial é baixa, o custo dos materiais filtrantes está se tornando cada vez mais alto.
No contexto acima, a filtração profunda tem sido aplicada cada vez mais no processo de separação citolíquida do FMDV. O material do filtro profundo é geralmente composto de fibras longas e finas de fontes naturais, e o canal formado pelo meio filtrante após a formação de um filme é muitas vezes muito tortuoso, semelhante à estrutura da abertura do labirinto. Partículas de impurezas geralmente ficam presas dentro do filtro e não na superfície. Além disso, a parede do canal de filtro absorve frequentemente uma parte de impurezas de partículas extremamente finas por ação eletrostática ou força intermolecular. Em geral, o mecanismo de filtração de filtração profunda é caracterizado por retenção mecânica e adsorção.
Método de filtragem de corrente constante
Instale a placa de filtro profunda no dispositivo de filtro de corrente constante, lave a placa de filtro com tampão PBS acima de 54 L/m2; Após a conclusão da lavagem, ligue a bomba peristáltica para bombear lentamente o líquido, ajuste lentamente a velocidade da bomba para aproximadamente a vazão esperada e filtre o líquido. Registre o volume de filtração, tempo, diferença de pressão e turbidez durante o processo de filtração. O filtrado foi coletado para detecção de antígeno.
Vantagens da filtragem profunda
A filtração de superfície é uma tecnologia que captura partículas na superfície do material do filtro para obter a filtração. O mecanismo de filtração baseia-se principalmente no tamanho das partículas na peneira do fluido, partículas grandes ficam presas na superfície da membrana do filtro. A filtragem profunda utiliza canais internos para interceptação e adsorção de partículas em profundidade. O diagrama de comparação dos dois é mostrado na Figura 1.
A solução inativada da vacina contra febre aftosa de um determinado fabricante foi pré-filtrada por 0 membrana de superfície de polipropileno de 0,45um e placa de filtro profunda, respectivamente, e depois filtrada por filtro bactericida de 00,2um. Os dados de filtrabilidade são mostrados na Tabela 1.
A turbidez da solução inativada da vacina contra febre aftosa é de 77 NTU. Se a bactéria for filtrada diretamente, um grande número de fragmentos celulares inevitavelmente fará com que a membrana do filtro 0.2um seja bloqueada rapidamente, o que afetará a transmissão das vipartículas 146S. Portanto, a pré-filtração foi projetada antes da filtração de desbacterialização, e os dois métodos de pré-filtração de filtração profunda e filtração de superfície foram comparados. A placa de filtro profundo de camada dupla é selecionada para filtração, a carga é de 641 L/m2 e o filtro profundo reduz o material de 77 NTU para 9,65 NTU, que é claro e brilhante. A carga de filtração de superfície de 0.45um é de apenas 46 L/m2, e a turbidez do líquido do filtro é tão alta quanto 41 NTU, o que não é adequado para pré-filtração. De acordo com a comparação da carga de filtração desbacterializada subsequente de 0 0,2um, a carga da membrana de filtração desbacterializada após a filtração profunda é de 655 L/m2, o que é 7,2 vezes a carga de filtração de filtração de superfície correspondente (apenas 91 L/m2) .
Os resultados do teste 146S mostram que o rendimento do sistema de filtração profunda é maior do que o do sistema de filtração de superfície. A carga de filtração profunda foi 13,9 vezes maior que a da filtração de superfície, a turbidez do líquido do filtro foi de apenas 23,5% daquela da filtração de superfície, e a carga de filtração subsequente de remoção de bactérias 0.2um foi 7,2 vezes maior que a do filtração de superfície. Portanto, tanto do ponto de vista do custo quanto do ponto de vista do rendimento, o sistema de filtração profunda é significativamente melhor do que o sistema de filtração por membrana de superfície.
Vantagens do filtro profundo de carga positiva forte
A placa de filtro profundo de carga positiva e a placa de filtro profundo de carga positiva forte foram usadas para comparar a solução inativada da vacina contra febre aftosa de diferentes fontes. Os resultados de filtrabilidade são mostrados na Tabela 2, e a mudança na velocidade de filtração e diferença de pressão no processo de filtração é mostrada no layout de cores 2.
Os dois grupos de placas de filtro profundo usados têm a mesma precisão de abertura e o desempenho é muito consistente do ponto de vista da mudança de carga e diferença de pressão, e a curva de mudança de diferença de pressão na Figura 2 é basicamente idêntica.
Porém, em relação à turbidez do líquido do filtro, a diferença é muito grande. O líquido do filtro da placa de filtro de camada dupla com carga positiva comum é de 25 NTU, enquanto o líquido do filtro da placa de filtro de camada profunda fortemente carregada positivamente com a mesma abertura é de apenas 9,65 NTU, o que é apenas 38,6% da placa de filtro profundo comum. Isto se deve principalmente ao ligante de resina especial no material de filtro de placa de filtro profundo de carga positiva forte. A turbidez é reduzida para menos de 10NTU pela placa de filtro de camada dupla fortemente positiva, e os fragmentos celulares são totalmente adsorvidos ou presos, o que conduz à ultrafiltração subsequente ou ao processo de filtração bactericida. Além do efeito de adsorção em detritos celulares insolúveis, Yigzaw Y et al também relataram o efeito de remoção de placa de filtro profundo fortemente carregada positivamente na proteína celular hospedeira, e Dorsey N et al relataram o efeito de remoção de placa de filtro profundo fortemente carregada positivamente no ADN.
Estabelecimento de processo de filtração de esclarecimento do sobrenadante da vacina contra febre aftosa por filtração profunda
Através do estudo comparativo acima de filtração de superfície e filtração profunda, e do estudo do efeito de clarificação da placa especial de filtro profundo de carga positiva forte, diferentes esquemas de filtração devem ser combinados com o sobrenadante inativado da vacina contra febre aftosa produzida sob diferentes condições de cultura. Para o sobrenadante centrífugo com 3 turbidez diferentes, baixa turbidez, média turbidez e alta turbidez, o esquema de filtração profunda e os parâmetros de filtração correspondentes são mostrados na Tabela 3.
Para o sobrenadante centrífugo com baixa turbidez, a placa de filtro profundo de camada única pode clarificar e remover eficazmente uma pequena quantidade de detritos celulares. Para o sobrenadante centrífugo de turbidez média, a placa de filtro profundo de camada dupla pode esclarecer efetivamente, especialmente a placa de filtro profundo de carga positiva forte pode reduzir a turbidez para menos de 5 NTU; Para sobrenadante centrífugo com maior turbidez, a placa de filtro combinada pode ser clarificada de forma eficaz. Não importa qual processo, a capacidade de processamento é de 500 ~800 L/m2, a turbidez do líquido do filtro é inferior a 20 NTU e o antígeno alvo é totalmente recuperado, adequado para produção em larga escala.
Discussão
Na década de 1970, o meio filtrante foi especificado para não usar materiais de amianto, devido à presença de substâncias cancerígenas nos materiais de amianto. O material do filtro profundo não contém amianto e possui uma carga positiva mais forte. O material do filtro é feito de matriz de fibra de madeira e auxiliar de filtro. No processo de produção, a resina polimérica é usada para conectar os componentes básicos, e os grupos funcionais de carga positiva nela contidos fornecem efetivamente a capacidade de adsorção de carga do material do filtro profundo. O excelente desempenho da filtração adsortiva profunda na capacidade de captura de partículas finas é mostrado na Figura 3.
Neste experimento, diferentes componentes de resina e diferentes materiais de filtro profundo de precisão foram selecionados para esclarecer o teste de filtração da solução de cultura de FMDV, e o teste de comparação foi realizado com filtração de superfície. Os resultados mostraram que a filtração profunda foi mais adequada para a remoção de detritos celulares do que a filtração de superfície, o que foi propício para a unidade de filtração de controle de carga microbiana subsequente (0,2um). Além disso, comparando o efeito de filtração da placa de filtro profundo de carga positiva forte e da placa de filtro profundo de carga positiva comum, a placa de filtro de carga positiva forte mostra uma forte capacidade de controle de turbidez, o que pode reduzir a turbidez para menos de 5 NTU, o que é muito propício para melhorar a robustez de todo o processo de filtração.
O processo de cultura a montante tem grande influência nas etapas de colheita dos ingredientes ativos. Através de testes, este experimento finalmente estabeleceu um esquema de filtração escalonável para meios de cultura celular com turbidez diferente, que tem certo significado orientador para a produção em larga escala.
O filtro de profundidade a ser lançado pela Guidling Technology é um elemento filtrante tipo disco, que é uma espécie de elemento filtrante eficiente com papelão filtrante profundo como material filtrante, atendendo integralmente aos requisitos regulatórios da indústria biofarmacêutica, principalmente projetado e fabricado especificamente para a remoção de grandes conteúdos sólidos, tais como células e fragmentos celulares, e podem ser aplicados a fluido de cultura de células de mamíferos; Esclarecimento de lisado de bactérias e células de levedura; Remoção de proteína da célula hospedeira (HCP); Remover vírus e DN; Remoção de endotoxinas; A remoção do antiespumante.
O produto tem as vantagens de pequeno volume morto, amplificação linear, estrutura de cápsula de disco, design de estrutura compacta e pode ser usado em série com outros equipamentos, área ocupada pequena, vazão estável, longa vida útil e baixo custo.