Estudo sobre o processo de clarificação de lisado de fermentação de alta densidade de Escherichia coli recombinante
A fim de reduzir a interferência do fluido material na cromatografia e melhorar a recuperação da proteína alvo, o processo de clarificação do lisado de fermentação de alta densidade de duas cepas de Escherichia coli recombinante foi estudado. As cepas BL21-HP1036 e BL21-palA expressando genes-chave de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis foram selecionadas. Processo de fluxo tangencial, processo de centrifugação de alta velocidade e processo de clarificação de cassete de membrana foram usados para avaliar o rendimento de proteína por turbidez e detecção por eletroforese.
Os resultados mostraram que o lisado de fermentação de alta densidade BL21-HP1036, BL21-palA expressando genes-chave de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis foi clarificado por filtração em cassete de membrana e centrifugação, e o rendimento de proteína foi superior a 80%, o que pode efetivamente reduzir a interferência cromatográfica e melhorar a taxa de recuperação.
Introdução
Atualmente, Streptococcus suis (SS) e Haemophilus parasuis (HPS) são os patógenos bacterianos mais comuns em granjas de suínos, que trazem grandes perdas para a indústria suína. SS pode ser dividido em um total de 35 sorotipos 1-34 e 1/2, e HPS pode ser dividido em 1-15 sorotipos, e os dois são frequentemente misturados, causando principalmente polisserosite suína, artrite, meningite, endocardite, septicemia bacteriana e bronquite.
Devido ao grande número de sorotipos de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis, a proteção cruzada entre diferentes sorotipos é fraca, e a resistência aos antibióticos aumentará significativamente quando tratados com antibióticos, o que afetará o efeito terapêutico.
As vacinas se tornaram um dos meios eficazes para prevenir SS e HPS. Existem vacinas inativadas, vacinas atenuadas, vacinas vivas, vacinas de subunidade e vacinas geneticamente modificadas, mas vacinas inativadas e vacinas atenuadas estão principalmente no mercado, e sua proteção imunológica é boa, mas a proteção cruzada não é óbvia. A vacina de subunidade é um novo tipo de vacina contra streptococcus suis, que é um novo tipo de vacina com forte proteção cruzada e baixo preço. A pesquisa e o desenvolvimento de vacinas de subunidade de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis fornecem uma solução perfeita para os problemas de prevenção e controle de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis que assolam a indústria suína na China.
As vacinas de subunidades de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis são submetidas à fermentação de alta densidade por Escherichia coli recombinante. A clarificação do lisado tem um grande efeito no rendimento das proteínas alvo, mas há poucos relatórios relevantes. Como realizar a etapa de clarificação do processo de fermentação e purificação é um trabalho importante. Neste artigo, a fermentação de alta densidade de E. coli recombinante BL21-HP1036, BL21-palA como objeto, para estudar como reduzir eficientemente a turbidez da solução de clarificação, melhorar o rendimento de proteína, para o processo de fermentação da vacina de subunidade de Streptococcus suis para atingir a tecnologia de britagem e clarificação industrial para fornecer base teórica e suporte técnico.
1. Materiais e métodos
1.1 Materiais
1.1.1 Cepas
Cepas de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Principais meios e reagentes
Extrato de levedura e boto; Cloreto de sódio; Canamicina, IPTG; Formaldeído de; Kit de gel SDS-PAGE.
1.1.3 Equipamento de teste principal
Fermentador de alta densidade; Centrífuga de alta velocidade; Aparelho de eletroforese; Sistema de imagem de gel ultravioleta; Triturador ultrassônico; Pequena centrífuga de alta velocidade; Espectrofotômetro ultravioleta; Mesa vibratória de temperatura constante; Equipamento de cromatografia de afinidade.
1.2 Métodos
1.2.1 Cultura de fermentação de alta densidade
As cepas de coliformes recombinantes qualificadas BL21-HP1036 e BL21-pa-lA foram inoculadas em meio sintético a 2% (V/V) e cultivadas a 37 graus por 35-40 h.
1.2.2 Expressão induzida por proteína recombinante
Quando a solução de fermentação OD{{0}}±0.1, a indução começou, a temperatura de indução foi de 35 graus ±0,5 graus, e a cultura foi encerrada após 10 horas de indução.
1.2.3 Britagem e centrifugação homogênea de alta pressão
O líquido bacteriano que passou no teste de inativação foi esmagado por um homogeneizador de alta pressão para quebra de células, respectivamente, com uma pressão de 100~150 MPa. Após a trituração, o líquido triturado foi mantido em baixa temperatura.
O sobrenadante foi obtido por centrifugação de alta velocidade, velocidade centrífuga: 15000 rpm, controle de temperatura: 10 graus ~15 graus, velocidade de injeção: 0,5~1 L/min, respectivamente, o sobrenadante foi coletado e o sobrenadante foi preenchido com recipientes que removeram a endotoxina.
1.2.4 Clarificação por cassete de membrana de microfiltração
A membrana foi lavada com 10L de água purificada em uma direção, e a filtração de fluxo tangencial foi realizada. 300 mL da suspensão bacteriana quebrada após centrifugação foi retirada da centrífuga de tubulação e clarificada com cassete de membrana de microfiltração de 0,45um. A turbidez foi medida por amostragem, respectivamente, e a turbidez após centrifugação, a turbidez do líquido clarificado no cassete de membrana de microfiltração e a turbidez do líquido concentrado no cassete de membrana de microfiltração foram comparadas. O conteúdo de proteína da amostra foi detectado por cromatografia e eletroforese para avaliar o rendimento de proteína.
Etapa 2: Resultados
2.1 Dados de esclarecimento e resultados de testes da proteína BL21-HP1036 e BL21-palA
Os resultados na FIG. 1 mostram que a turbidez do fluido de trituração de Escherichia coli recombinante BL21-HP1036 e BL21-palA diminuiu de 4 500 NTU e 4 000 NTU para 1970 NTU e 520 NTU, respectivamente, após centrifugação em tubo. A turbidez de Escherichia coli recombinante BL21-HP1036 e BL21-palA foi reduzida para 25 NTU e 1,28 NTU pelo método de cassete de membrana de microfiltração. Pode-se observar que o uso de filtração de fluxo tangencial de cassete de membrana de microfiltração e canal de fluxo aberto otimizado tem um bom efeito na redução de endotoxina, viscosidade e turbidez do líquido cromatográfico do que a filtração centrífuga tradicional e pode reduzir significativamente a heteroproteína e o ácido nucleico de E. coli recombinante quebrados.
2.2 Recuperação de proteínas das amostras BL21-HP1036 e BL21-palA
A Tabela 1 mostra que a proteína Escherichia coli BL21-HP1036 recombinante existe tanto na solução clarificada por microfiltração quanto no sobrenadante concentrado coberto pela membrana de microfiltração, e o rendimento total de proteína após a recuperação da proteína da solução clarificada por microfiltração e do sobrenadante concentrado é de cerca de 88,5%. A proteína BL21-palA também existia na solução clarificada de exsudato de microfiltração e no sobrenadante da solução concentrada coberta pelo cassete de membrana de microfiltração. O rendimento total da proteína BL21-PALa foi de 81,5%.
3. Conclusão
Neste artigo, as cepas que expressam os genes-chave BL{{0}}HP1036 e BL21-palA de Streptococcus suis e Haemophilus parasuis, respectivamente, passaram por fermentação de alta densidade e passaram por 0,45. A turbidez do líquido do material foi significativamente reduzida pelo processo de cassete de membrana de microfiltração um, indicando que a tecnologia de filtração de fluxo tangencial com cassete de membrana de microfiltração foi melhor do que aquela com centrífuga de alta velocidade e poderia reduzir significativamente a proteína de impureza e o ácido nucleico da Escherichia coli recombinante quebrada.
Após coletar o líquido claro no cassete de membrana de microfiltração única, houve 62,9%. Como 37,1% da proteína alvo de BL21-HP1036 era concentrado de microfiltração ou existia no cassete de membrana de microfiltração e outras perdas, um método de duas etapas foi adotado para clarificação. Na primeira etapa, o cassete de membrana de microfiltração de 0,45 µm foi usado para clarificar e coletar o exsudato; na segunda etapa, o líquido concentrado restante foi coletado após centrifugação em tubo, e o líquido clarificado em duas etapas foi combinado como a amostra cromatográfica. O valor de turbidez do líquido de fermentação BL21-palA não aumentou significativamente, o rendimento de proteína pode atingir mais de 85,5%, e o rendimento de proteína do líquido de fermentação BL21-Pala pode atingir 81,5% após o tratamento em duas etapas.
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