Resumo:

Este artigo analisa dois fatores -chave que devem ser considerados nas estratégias de purificação de proteínas: requisitos de aplicação a jusante e as características biológicas das próprias proteínas. O artigo enfatiza que a purificação de proteínas de alta qualidade é a base para a confiabilidade e repetibilidade de dados experimentais, especialmente para a produção de proteínas recombinantes. Diferentes cenários de aplicação têm requisitos específicos para a pureza, atividade ou endotoxina das proteínas, e as características das proteínas podem afetar significativamente as estratégias de purificação. De acordo com casos específicos, o artigo ilustra que proteínas exclusivas devem adotar esquemas de purificação personalizados. Finalmente, foi proposto um processo sistemático de produção de proteínas (Figura 1), enfatizando o controle de qualidade de processo total da seleção de sistemas de expressão, projeto de construção para otimização de purificação e recomendando a avaliação da homogeneidade e funcionalidade de proteínas através de técnicas biofísicas (como SEC-Mals, DSF, etc.). Este artigo tem como objetivo fornecer orientações práticas para os pesquisadores, ajudando -os a formular estratégias de purificação eficientes e repetíveis com base nas características e requisitos de aplicação das proteínas -alvo, aumentando assim a qualidade e a eficiência da pesquisa científica.

 

Figura 1. Diagrama esquemático do processo de produção de proteínas

 

Produção de proteínas de alta demanda - exemplos de identificação de problemas, design da estratégia de mitigação e saída correspondente

 

1. Ligação do ácido nucleico à proteína:

Ao purificar as proteínas de ligação ao ácido nucleico, são necessárias várias etapas para remover a contaminação do ácido nucleico. Durante a lise, nucleases (como nuclease de SM (benzonase®) ou DNase ou RNase) precisam ser adicionadas, mas os ácidos nucleicos ligados não podem ser completamente removidos. Substitua as etapas de remoção do ácido nucleico, como PEI ou precipitação de sulfato de estreptomicina, purificação de heparina ou cromatografia em troca de íons. A presença de ácidos nucleicos foi monitorada pela razão de A26 0 nm\/a28 0 nm em todo o processo de purificação. Se a razão foi menor que 0,6, indicou que a pureza da proteína era relativamente alta e a contaminação do ácido nucleico era mínima. Para proteínas com ácidos nucleicos fortemente ligados, eles podem ser temporariamente desnaturados (como tratados com uréia) e depois renaturados. Pontos-chave: use reagentes de alta qualidade, buffers frescos e colunas limpas (limpe com 0,5m NaOH antes do uso).

 

2. Cadeia pesada de ferritina de mouse:

O objetivo de produzir a proteína da cadeia pesada de ferritina purificada de camundongo (MFTH1) é a microscopia crioeletrônica de partículas únicas de alta resolução (crio-EM). O vetor de expressão de Escherichia coli codificado MFTH1 não marcado foi interrompido ultrasonicamente sem adicionar nuclease. Após o aquecimento a 7 0, ele foi submetido a etapas de precipitação de sulfato de amônio, diálise e exclusão de tamanho. A amostra resultante mostrou a presença de uma grande quantidade de contaminantes em imagens de microscopia crio-eletrônica (Figura 2A), o que era completamente inadequado para sua aplicação. Otimize as etapas. Adicione a nuclease de SM durante o processo de lise celular e o processo de diálise após a precipitação do sulfato de amônio e adicione a etapa da cromatografia de troca ânion para reduzir a proporção de A26 0 nm\/a280nm de 1,4 para 0,8. Após a cromatografia de exclusão de tamanho, a proporção de A260NM\/A280NM da amostra final do MFTH1 foi de 0,56. As imagens de microscopia SDS-PAGE e crio-elétron (Figura 2B) mostraram que a proteína era muito pura, indicando que os contaminantes haviam sido efetivamente removidos.

Figura 2 Cadeia pesada de ferritina de mouse

 

 

 

3. Proteína quimérica Human Dsrbec (DSRBD-EGF-Chimera):

O DSRBEC é formado pela fusão do domínio de ligação ao RNA de fita dupla (DSRBD) da proteína quinase R humana e do fator de crescimento epidérmico humano (HEGF). Quando o DSRBD é expresso em Escherichia coli, ele mostra uma capacidade de ligação a dsRNA extremamente alta. Após a lise celular, o RNA contaminente impedirá a ligação de proteínas recombinantes à coluna de cromatografia de afinidade de íons metálicos fixo (IMAC). Métodos convencionais, como PEI ou precipitação de sulfato de estreptomicina, tratamento com RNase ou soluções de tampão de alto sal, não podem remover o RNA. A lise celular foi realizada usando um tampão contendo uréia de 4M. O sobrenadante foi carregado em uma coluna IMAC e 4m a 0 m uréia foi lentamente usado durante a noite (renaturação da coluna). O buffer de renaturação foi adicionado com imidazol e eluído da coluna IMAC. O refinamento final foi realizado através da filtração do Gel Superdex 75 para obter o DSRBEC funcionalmente ativo.

 

4. Proteínas ligadas a cátions divalentes ou outros cofatores:

Para proteínas que interagem com cátions divalentes como Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ ou outros cofatores, é crucial adicionar cátions divalentes específicos (ou outros cofatores) durante a expressão. Uma pequena quantidade dos mesmos cátions divalentes (ou outros cofatores) também é necessária durante o processo de purificação. No entanto, o uso de quaisquer agentes quelantes (como EDTA, EGTA) e agentes redutores quelantes (como DTT ou DTE) devem ser evitados. Ao lidar com proteínas ligadas a cátions divalentes, uma mistura de inibidores de protease sem agentes quelatórios deve ser usada para confirmar a presença real de cátions divalentes (ou outros cofatores) na proteína purificada através de métodos espectroscópicos (como espectrofotometria de absorção atômica).

 

5. Feridoxina recombinante (RFD) contendo um único cluster [2FE ± 2S] de cianobactérias termofílicas mastigocladus laminosus

A feridoxina é uma proteína solúvel de ferro-sulfur que participa de reações de transferência de elétrons. A feridoxina do tipo planta carrega um único cluster [2FE ± 2S] como aceitador de elétrons do fotossistema I. A cepa Escherichia coli BL21 (DE3) expressou a proteína RFD recombinante no meio TB contendo FECL3 e antibióticos de 10 mm. A eluição da coluna de captura do IMAC foi realizada usando um tampão contendo 10mm histidina para evitar o imidazol e impedir a destruição do cluster [2FE ± 2S]. A cromatografia de troca de ânion e exclusão de tamanho foram usados ​​para purificação e concentração adicionais a 12 mg\/mL para a triagem de cristalização. Comparado com a produção recombinante de feridoxina, a feridoxina natural purificada das algas verde-verde mastigocladus laminosus alcançou maior resolução durante a cristalização.

 

6. Proteínas usadas como antígenos

As proteínas são frequentemente usadas como antígenos para recuperar ligantes específicos do alvo. A primeira coisa a considerar é se a proteína é usada para imunidade in vivo para obter IgG monoclonal ou policlonal convencional ou para programas envolvendo processos de seleção de camelo ou de seleção in vitro.

 

6.1 Antígenos usados ​​para produção de anticorpos de rotina

Quando os antígenos são usados ​​para produzir anticorpos IgG monoclonais, o dobramento correto do antígeno geralmente não é necessário, porque a maioria dos anticorpos monoclonais reconhece epítopos lineares que não são muito afetados pela estrutura do antígeno e até antígenos desnaturados (como proteínas do corpo de inclusão) permanecem eficazes. No entanto, a pureza deve ser estritamente controlada para evitar fortes contaminantes imunogênicos interferindo na resposta imune e causando o domínio de anticorpos não alvos.

 

6.2 Triagem da biblioteca conjugada

Atenção especial deve ser dada à manutenção da conformação natural do antígeno durante o processamento da biblioteca de nanoborpos obtida pela imunização de camelo. Ao contrário dos anticorpos convencionais, os anticorpos de camelo (especialmente nanoborpos) tendem a reconhecer epítopos estruturais, que estão relacionados à sua estrutura de local complementar convexa única. Da mesma forma, ao rastrear grandes bibliotecas de anticorpos sintéticos ou naturais in vitro, o antígeno deve manter uma estrutura completamente consistente com a aplicação de destino. Como o processo de triagem em si é não tendencioso, se o antígeno tiver dobrado, agregação ou heterogeneidade conformacional, um grande número de conjugados direcionados a epítopos não naturais pode ser rastreado.

 

 

 

7. proteínas contendo ligações dissulfeto intermolecular ou intramolecular ou cisteína livre

As ligações dissulfeto são cruciais para estabilizar a estrutura natural das proteínas. Durante o processo de purificação, ao purificar proteínas contendo ligações dissulfeto intermolecular ou intramolecular, é necessário evitar adicionar agentes redutores para evitar alterações conformacionais das proteínas, alterando assim suas funções. Para proteínas contendo cisteína livre, os agentes redutores são indispensáveis ​​em todas as etapas do processo de purificação, especialmente durante o armazenamento, para impedir a formação de ligações dissulfeto artificial. Os agentes redutores mais usados ​​são o ditiotreitol (DTT), -Mercaptoethanol (-ME) e Tris (2- carboxietil) cloridrato de fosfina (tcep). Para resinas IMAC que são incompatíveis com o DTT ou TCEP, é recomendável usar -Me e substitua -os por outros agentes redutores nas etapas subsequentes.

 

8. Fragmento de anticorpo recombinante

Embora a estrutura dos fragmentos de anticorpos recombinantes (como nanoboros) seja mais simples que a da IgG, sua função depende da formação correta de ligações dissulfeto. Nos sistemas de expressão bacteriana, mesmo com a adoção de estratégias de otimização, ainda podem ocorrer produtos dobrados ou parcialmente dobrados, que existem na parte solúvel e no corpo de inclusão. O mais oculto é que até os fragmentos de anticorpos dobrados corretamente podem formar agregados solúveis (agregação colóide) através de placas hidrofóbicas na superfície. Tais agregados são difíceis de identificar em testes funcionais de rotina (como ELISA) porque a ligação multivalente pode mascarar o declínio na afinidade de monômero, mas sua presença pode afetar seriamente aplicações que dependem do tamanho de uma molécula pequena (como microscopia de super-resolução). Portanto, confiar apenas no SDS-PAGE é insuficiente para avaliar a qualidade da amostra. Métodos biofísicos como a filtração em gel (Figura 3) devem ser adotados para distinguir monômeros (picos principais) dos agregados (picos de volume de exclusão). Os pontos de controle das chaves incluem: otimizar o ambiente redox durante a expressão para promover a formação de ligações dissulfeto e otimizar as condições de armazenamento após a purificação para evitar a agregação. Essas medidas são cruciais para garantir a monodispersidade e a função dos fragmentos de anticorpos.

Figura 3. Separação de filtração em gel de agregados solúveis de nanobodos

 

9. Fragmentos solúveis do receptor de linfócitos LLT1

A expressão recombinante de proteínas dependentes da ligação dissulfeto (como o receptor de linfócitos LLT1) geralmente enfrenta dificuldades de dobragem. A filtração em gel de LLT1 do tipo selvagem mostrou picos de agregação e picos de dímero (Figura 4A), mas a espectrometria de massa revelou desdobramento causado por cisteína não pareada no dímero (Figura 4B). Para esse fim, dois mutantes foram projetados: um removeu o problema da cisteína, resultando em uma queda repentina no rendimento (Figura 4A); Após a introdução da neocisteína para reconstruir a ligação dissulfeto conformada, o mutante não apenas teve um alto rendimento e boa estabilidade, mas também poderia cristalizar (Figura 4C), e a estrutura 3D confirmou que o mutante formou a ligação dissulfeto correta e mantinha a dobra natural. Este caso demonstra que, ao projetar racionalmente as ligações dissulfeto conforme, combinadas com a filtração em gel e a análise de espectrometria de massa, o problema de dobragem das proteínas recombinantes pode ser resolvido e efetivamente e proteínas funcionais com estruturas estáveis ​​e altos rendimentos podem ser obtidos.

Figura 4. A reconstrução da ligação dissulfeto melhora a dobra e o rendimento de LLT1 solúvel

 

 

 

10. Proteínas facilmente agregáveis

A purificação de proteínas recombinantes geralmente enfrenta o problema da agregação, e sua formação segue o mecanismo de "crescimento de nucleação"-uma pequena quantidade de agregados solúveis se forma primeiro e depois desencadeia uma agregação insolúvel em larga escala. Para enfrentar esse desafio, as estratégias de vários níveis precisam ser adotadas: no estágio de expressão, isso pode ser alcançado otimizando a tensão, reduzindo a temperatura da cultura, usando meios de cultura modificados ou diferentes proteínas de fusão solubilizantes e substituindo os sistemas de expressão e o estágio de um ambiente de rapidamente (em um ambiente de rapidamente (em um ambiente de rapidamente (em um ambiente de rapidamente (em um ambiente de rapidamente, a operação de pura e a operação rápida (em um ambiente de 4 graus) é necessário do iMac to Sec) deve ser adotado para remover prontamente núcleos agregados. De um modo geral, ao rastrear soluções de buffer, fatores como composição de componentes, valor de pH, agente de dissociação ou solubilizador devem ser levados em consideração (Figura 5). Através da otimização fina da detecção ortogonal (como SEC, CD, LS, DSF e mudança de temperatura com base no calor da fluorescência, etc.), a qualidade da proteína e a solução tampão mais adequada foram determinadas.

Figura 5. Estratégias para aliviar a agregação de proteínas

 

11. Cristalização da CLK1 quinase humana (como obter lotes reproduzíveis)

Para obter o CLK1 quinase não fosforilado homogêneo para estudos de cristalização, foi adotado um esquema colaborativo de várias estratégias. Em primeiro lugar, foi co -expresso com a λ -fosfatase em Escherichia coli para eliminar a heterogeneidade da autofosforilação. Embora o rendimento tenha sido reduzido, a desfosforilação completa foi garantida. Após a captura do IMAC, o eluente foi suplementado com estabilizadores (arginina de 50 mm, ácido glutâmico de 50 mm e DTT de 10 mm) para impedir a agregação, concentrada, e a etiqueta foi removida pela digestão Tev. Em seguida, o oligômero correto foi separado por seg (contendo 5% de glicerol e -me). A etapa final de troca do ânion crucial distingue entre grupos cristalinos (não fosforilados) e não cristalinos (parcialmente fosforilados). Vale particularmente a pena notar que o modo de lise celular afeta significativamente a estabilidade das proteínas-o método de alta pressão e alta temperatura leva à agregação irreversível do CLK1, destacando a importância do tratamento leve para a preparação da quinase.

 

 

 

12. Produza galectina -1 com capacidade estável de ligação ao ligante

Para preparar a galectina funcional -1 para estudos de ligação ao ligante, as estratégias de expressão e purificação de quatro construções (galectina de tipo selvagem não marcadas e com a galectina do tipo selvagem -1}, não foi comparado a cisteína sem etiqueta. Os principais achados indicam que a purificação da cromatografia de afinidade de lactose pode rastrear efetivamente as proteínas dobradas corretamente, mas precisa ser combinada com diálise completa (tampão HEPES) para remover completamente a lactose do local de ligação e restaurar a atividade da CRD. A galectina do tipo selvagem -1 é propensa a oxidação e inativação, e sua estabilidade permanece limitada mesmo na presença de agentes redutores (Figura 6). No entanto, o mutante livre de cisteína aumenta significativamente a estabilidade a longo prazo, mantendo a atividade de aglutinação comparável e a estabilidade térmica (verificada por nanodsf, ITC, etc.), eliminando a dependência da ligação dissulfeto.

Figura 6. A caracterização hidrodinâmica da galectina recombinante -1 revela sua instabilidade

 

13. Remoção de endotoxina

O método de remoção de endotoxina é baseado na cromatografia de afinidade, incluindo cromatografia com carga positiva (troca de ânion), o uso de ligantes policatiais (como poli-l-lisina (PLL), poliamina imobilizada (polimixina B)) e a adição do surfato triton x {}}}. Durante o processo de purificação, preste atenção à preparação da solução buffer com água livre de LPS e use novas colunas ou colunas que foram usadas apenas em outras purificações sem LPS. Para contaminação por endotoxina, o sistema cromatográfico da bomba\/fluido pode ser incubado durante a noite em 0. 5m NaOH ou por 4 horas em 1. 0 m NaOH. A quantidade final de LPS na amostra foi avaliada usando o reagente de lisado de amebócitos Limulus (LAL) e foi verificado se estava abaixo do limite necessário para a aplicação específica.

 

14. Complexo proteico

A expressão e a purificação dos complexos de proteínas precisam ser otimizados de acordo com condições específicas. Os desafios incluem a instabilidade ou desdobramento das subunidades. Cada subunidade pode ser expressa de forma independente e montada in vitro, ou co-expressa para formar complexos proteicos funcionais. O projeto da construção deve ser cuidadosamente introduzido com rótulos de purificação ou detecção para evitar interferir na montagem, especialmente quando a informação complexa é limitada e várias otimizações são necessárias. Durante o processo de purificação, a integridade e a estabilidade do complexo precisam ser avaliadas. Os métodos incluem SDS-PAGE (Detecção de Subunidade), SEC (homogeneidade), SEC-Mals (análise de massa molar), fotometria de massa ou espectrometria de massa natural (verificação em massa). Deve -se notar que o complexo pode se dissociar em baixas concentrações. Neste momento, o método ou buffer cromatográfico (como através da deriva térmica ou condições de triagem DSF) precisa ser otimizado. Além disso, a redução das etapas de purificação pode impedir a perda de subunidades de interação fraca e equilibrar a eficiência da purificação e a integridade do complexo.

 

 

 

15. Purificação de complexos antígenos-anticorpos

Os complexos anticorpos-antígenos são exemplos típicos de complexos proteicos. Sua co-cristalização pode revelar padrões de ligação e orientar a otimização da engenharia de anticorpos. Os métodos tradicionais requerem purificação separada de antígenos e anticorpos e depois misturam -os. No entanto, estudos recentes mostraram que as estratégias de co-expressão e co-purificação são mais eficientes. Somente uma única purificação é necessária para obter o complexo e, ao mesmo tempo, antígenos instáveis ​​podem ser estabilizados através de anticorpos, e até a expressão sem rótulo pode ser alcançada. Nesta situação específica, SDS-PAGE e Filtração de Gel (SEC) geralmente são suficientes para avaliar a pureza e a qualidade do complexo.

 

Resumo

A purificação de proteínas é uma tecnologia fundamental em pesquisa científica. A produção de proteínas em escala acadêmica geralmente segue estratégias padrão e pode produzir proteínas solúveis em nível de miligrama, que são amplamente utilizadas em biologia estrutural, bioquímica e pesquisa funcional. No entanto, os requisitos especiais de aplicações a jusante (como a necessidade de nenhuma endotoxina em experimentos com animais e nenhuma contaminação por nuclease na pesquisa de ácidos nucleicos) ou as características inerentes das proteínas (como agregação fácil, contendo ligações dissulfeto ou alta afinidade de ácido nucleico) geralmente requerem soluções personalizadas. Esta revisão, em resposta a essas circunstâncias especiais, propõe estratégias refinadas, desde a seleção de sistemas de expressão, o design de construções (otimizando rótulos e limites de domínio) até o processo de purificação e introduz o controle de qualidade (como SEC, SDS-PAGE, Detecção de atividades, etc.) nas etapas-chave. Algumas aplicações também requerem análises adicionais (como detecção de endotoxina e determinação de resíduos de ácido nucleico), semelhante ao conceito de "garantia de qualidade" (controle de qualidade) na indústria biofarmacêutica, ou seja, para evitar defeitos através de processos sistemáticos. Ao formular diretrizes de controle de qualidade e esclarecer padrões específicos para reagentes de proteínas usados ​​na pesquisa científica, o objetivo é estabelecer normas de purificação de proteínas mais rigorosas para laboratórios acadêmicos, aumentar a confiabilidade e a repetibilidade de dados experimentais e preencher a lacuna entre pesquisa básica e padrões industriais.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5